唐華麗孫桂菊陳 忱

TANG Hua－li1，2SUN Gui－ju2CHEN Chen2

（1.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 萬(wàn)州 404000；2.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009）

糖尿病是嚴(yán)重影響人類健康的非傳染性疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估算［1］，目前全球約有1.8億糖尿病患者，其中中國(guó)為3 000萬(wàn)人。而到2030年糖尿病患者的數(shù)量將會(huì)成倍的增加，中國(guó)的糖尿病患者總數(shù)將接近1億人，是臨床亟待解決的問題之一。研究［2］證明，長(zhǎng)期使用常見的臨床降糖藥，效果不佳，且有較嚴(yán)重的副作用，因此世界各國(guó)醫(yī)務(wù)工作者和研究人員紛紛致力于從天然藥物中篩選和研究降糖藥物。

枸杞子為中國(guó)國(guó)家公布的藥食同源品種之一，具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值［3，4］。其中枸杞多糖 （Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP）作為枸杞發(fā)揮功效的重要活性成分而成為近年來(lái)一個(gè)研究的熱點(diǎn)。枸杞多糖能夠降低動(dòng)物及Ⅱ型糖尿病患者空腹和餐后血糖的作用已被證實(shí)，但是關(guān)于枸杞多糖是如何進(jìn)入體內(nèi)，代謝生成何種物質(zhì)，代謝組分如何發(fā)揮功效作用等問題尚不清楚。文章就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在枸杞多糖化學(xué)分析和降血糖作用方面的研究進(jìn)行綜述，旨在為枸杞多糖的吸收、代謝以及降血糖機(jī)制等研究提供參考。

1 枸杞多糖的化學(xué)分析

1.1 枸杞多糖的純度鑒定

枸杞多糖的生物學(xué)活性與其相對(duì)分子質(zhì)量有很大關(guān)系，因此在對(duì)枸杞多糖生理功能及其作用機(jī)制的深入研究中，相對(duì)分子質(zhì)量是一個(gè)重要指標(biāo)。要測(cè)定枸杞多糖的相對(duì)分子質(zhì)量，首先要求鑒定其純度。多糖的純度標(biāo)準(zhǔn)不能用一般化合物的純度標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量，因?yàn)榧幢闶嵌嗵羌兤罚湮⒂^結(jié)構(gòu)也是不均一的，它實(shí)際上是一定相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)的多糖的均一組分，它的純度只能代表相似鏈長(zhǎng)的多糖分子的平均分布。國(guó)內(nèi)外對(duì)枸杞多糖純度鑒定的方法有比旋度法、層析法、超離心法、電泳法、色譜法、示差折射法、紫外檢測(cè)法等［5］。在實(shí)際應(yīng)用中，一般至少需要兩種方法同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行純度驗(yàn)證。王建華［6］對(duì)純化后的枸杞多糖亞組分同時(shí)采用Sephadex G－200和SDS－PAGE進(jìn)行純度驗(yàn)證，結(jié)果均表明枸杞多糖各亞組分分子量分布均一。張民等［7］同時(shí)采用瓊脂糖凝膠電泳法及高效液相色譜法（HPLC）對(duì)經(jīng)DEAE纖維素和Sephadex G－75色譜柱純化后的枸杞多糖組分進(jìn)行純度驗(yàn)證，結(jié)果均表明LBP－4a和LBP－5b都是均一的多糖組分。朱彩平等［8］采用瓊脂糖凝膠電泳和紙色譜的方法驗(yàn)證經(jīng)Sephadex G－75純化后收集的多糖組分為單一組分。近年來(lái)，高效凝膠滲透色譜（HPGPC）結(jié)合示差檢測(cè)器檢測(cè)的方法［9－13］。由于其省時(shí)、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于多糖的純度測(cè)定中，多糖組分經(jīng)凝膠色譜得到一對(duì)稱峰，通過面積歸一化法計(jì)算不同相對(duì)分子質(zhì)量多糖的組成。

1.2 枸杞多糖含量的測(cè)定

目前枸杞多糖含量測(cè)定最常用的方法是苯酚—硫酸法［14－17］和蒽酮—硫酸法［18，19］，其原理是多糖在強(qiáng)酸作用下首先水解為單糖，然后迅速脫水生成糠醛或糠醛衍生物，糠醛物質(zhì)與酚類或胺類化合物縮合，生成有特殊顏色的物質(zhì)，利用有色物質(zhì)在特定波長(zhǎng)下的吸收強(qiáng)度來(lái)計(jì)算枸杞多糖的含量。但同時(shí)這兩種方法在測(cè)定枸杞多糖含量方面還存在爭(zhēng)議，其一是因?yàn)槎嗵潜旧聿⒉皇怯赡骋惶囟▎翁墙M分構(gòu)成，且枸杞多糖為一種蛋白多糖，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物參照不合理；其次枸杞多糖的純化很難完全排除單糖等雜質(zhì)組分的干擾。此外，也有人［20－23］將比旋度法、示差折射法、紫外檢測(cè)和硫酸—咔唑法等應(yīng)用于多糖的成分檢測(cè)。

1.3 枸杞多糖相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

多糖的生理活性通常與其相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）有關(guān)，因此測(cè)定枸杞多糖的Mr是深入研究其構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)制的重要工作。多糖的Mr只能代表相似鏈長(zhǎng)的平均分布，有數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量（Mn）、重均相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）和粘均相對(duì)分子質(zhì)量（Mv）3種表示方法，文獻(xiàn)資料通常使用Mw表示多糖的Mr。過去用于測(cè)定多糖Mr的方法主要有：超速離心沉降法、滲透壓法、蒸汽壓法、端基法、光散射法、黏度法、凝固點(diǎn)下降法等［5］，可根據(jù)待測(cè)多糖的分子量范圍選擇測(cè)定。目前常用于枸杞多糖Mr測(cè)定的方法主要有：凝膠滲透色譜 法［9，24，25］和高效 液 相 色 譜 法［7，13，26］，這 兩 種 方 法 均 要 以已知Mr的標(biāo)準(zhǔn)系列右旋糖酐（dextran）作對(duì)照來(lái)測(cè)定枸杞多糖的Mr。為了避免標(biāo)曲制作時(shí)試驗(yàn)步驟繁瑣以及試驗(yàn)誤差，周鵬等［26］采用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（HPLCMS）的方法對(duì)茶多糖蛋白進(jìn)行分子量測(cè)定，王戰(zhàn)勇等［9］采用凝膠滲透色譜和激光光散射聯(lián)用儀（GPC－LLS）測(cè)定枸杞多糖的Mr，既不需使用多糖標(biāo)準(zhǔn)品又取得了理想的試驗(yàn)效果。

1.4 枸杞多糖的分析方法及結(jié)構(gòu)描述

1.4.1 枸杞多糖結(jié)構(gòu)分析方法 同樣是生物大分子，多糖的結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)和核酸復(fù)雜，沿用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分類方法將多糖分為一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)［27］，其中一級(jí)結(jié)構(gòu)為初級(jí)結(jié)構(gòu)，包括糖基的組成、糖基排列順序、相鄰糖基的連接方式、異頭碳構(gòu)型以及糖鏈有無(wú)分支、取代位置、官能團(tuán)類型和含量等。二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)為高級(jí)結(jié)構(gòu)，是指多糖鏈在以氫鍵和非共價(jià)鍵為主的作用下連接而成的空間構(gòu)象。糖鏈結(jié)構(gòu)的微觀不均一性，使糖鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定工作更加復(fù)雜化，所以目前對(duì)枸杞多糖結(jié)構(gòu)的研究多限于其一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，主要有化學(xué)分析法、儀器分析法、生物學(xué)方法以及它們之間聯(lián)用的方法，主要結(jié)構(gòu)分析方法見表1。

表1 多糖結(jié)構(gòu)分析方法Table1 The structure analysis method of polysaccharide

1.4.2 枸杞多糖的結(jié)構(gòu)描述 研究枸杞多糖的結(jié)構(gòu)對(duì)其發(fā)揮生理功能的作用機(jī)制的深入研究，以及更好的利用和開發(fā)枸杞多糖具有重要意義。由于組成枸杞多糖的單糖種類和數(shù)目等的不同，其結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)枸杞多糖的結(jié)構(gòu)研究主要集中在其分子量測(cè)定、單糖組成及比例、糖環(huán)形式（吡喃環(huán)或呋喃環(huán)）、單糖殘基類型及糖苷鍵連接位點(diǎn)、糖苷取代的異頭異構(gòu)形式（α－或β－）等初級(jí)結(jié)構(gòu)的表達(dá)上。趙春久等［36］采用DEAE柱層析法從枸杞多糖中分離得到4個(gè)水溶性多糖均一體，除LBPC4的分子量1.0×104，為α－（1→4）（1→6）連接的葡聚糖肽外，LBPC3、LBPC2、LBPC1分別為分子量6.6×104、1.2×104、0.8×104，β－（1→4）（1→6）連接的雜多醣肽。田庚元等［37］早期研究從枸杞子中分離純化得到一種糖蛋白LbGP，經(jīng)電泳法測(cè)定分子量為88kD，該糖蛋白含量為70%，蛋白質(zhì)含量30%，檢測(cè)出16種氨基酸，單糖組成為Arb∶Gal∶Glu＝25∶10∶1，為Glycan－O－Ser鏈接的糖蛋白。郭琦等［38］將純化得到的枸杞多糖組分LBP3－I進(jìn)行結(jié)構(gòu)和組成分析，紅外光譜表明LBP3－I具有明顯的糖類物質(zhì)特征吸收峰且含有吡喃環(huán)，掃描電鏡觀察得知LBP3－I主要呈鏈狀伴隨著高度分支結(jié)構(gòu)，且糖鏈間多相互纏繞聚集成環(huán)狀，氣相色譜分析得出其單糖組成分別為鼠李糖基、阿拉伯糖基、木糖基、甘露糖基、葡萄糖基和半乳糖基，且摩爾比率為2.07∶2.38∶3.11∶1.00∶1.12∶2.86，是一種含有結(jié)合蛋白的多糖復(fù)合物，和田庚元的研究結(jié)論相符。Zou等［39］將經(jīng)DEAE離子交換純化得到的LBP－1進(jìn)行 HPLC和GC分析，得出LBP－1由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和半乳糖醛酸殘基組成，摩爾比為1.00∶7.85∶0.37∶0.65∶3.01∶8.16，對(duì) LBP－1進(jìn)行 FT－IR、GCMS、1H－NMR和13C－NMR分析，研究結(jié)果表明：各單糖的連接順序依次為（1→5）－α－D－阿拉伯糖－（1→4）－α－D－半乳糖醛酸，通過－（3→6）－連接－（1）－甘露糖分支，鏈終端連接－（1）－甘露糖。目前對(duì)枸杞多糖的結(jié)構(gòu)鑒定與描述均建立在：對(duì)枸杞多糖進(jìn)行分離純化得到各種分子量均一的多糖組分，然后選取相對(duì)含量較多的組分按表1的方法進(jìn)行分析，按照單糖的組成和糖苷鍵連接順序?qū)M分多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述。隨著分析分離技術(shù)的發(fā)展，糖鏈結(jié)構(gòu)分析工作進(jìn)展迅速，趨向于用少量樣品（幾十微克到幾毫克）在較短時(shí)間內(nèi)（幾星期內(nèi)）就能得到糖鏈結(jié)構(gòu)的大部分或幾乎全部信息。相比之下，目前對(duì)化學(xué)和儀器分析方面的技術(shù)方法研究較多，生物學(xué)方面的方法研究還比較薄弱。

2 枸杞多糖的降血糖作用

大量研究表明枸杞及其多糖具有降低血糖功能，可能是通過改善胰島細(xì)胞形態(tài)功能、修復(fù)受損胰島細(xì)胞和促進(jìn)胰島細(xì)胞再生，從而達(dá)到降低血糖水平的作用。Zou等［39］研究了枸杞多糖LBP－1對(duì)大鼠胰島細(xì)胞RINm5F和人體肝細(xì)胞HepG2的體外降血糖試驗(yàn)，結(jié)果表明：LBP－1具有保護(hù)胰島細(xì)胞免受氧化損傷、顯著提高細(xì)胞存活率以及減輕HepG2的胰島素抵抗作用，對(duì)開發(fā)降血糖功能食品和藥物具有重要參考價(jià)值。趙蕊等［40，41］分別給予Ⅱ型糖尿病小鼠枸杞多糖高（40mg／kg·BW）、低（20mg／kg·BW）2個(gè)劑量水平，考查枸杞多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠胰島細(xì)胞形態(tài)和功能的影響，給藥中期和后期高、低劑量組血糖濃度與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05），并呈現(xiàn)出一定劑量－效應(yīng)關(guān)系，圖像分析結(jié)果表明枸杞多糖可以改善Ⅱ型糖尿病小鼠胰島細(xì)胞形態(tài)和功能并促進(jìn)胰島素的分泌，有良好的降血糖作用。王玲等［42］對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)制備的糖尿病小鼠模型預(yù)防性灌胃LBP－D，觀察枸杞多糖LBP－D對(duì)帶病小鼠和正常小鼠的血糖水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在注射四氧嘧啶前4，1h，用LBP－D灌胃給藥可使小鼠血糖濃度從對(duì)照組的21.3mmol／L降至注射四氧嘧啶后72h的10.2mmol／L，表明LBP－D有明顯預(yù)防血糖升高作用。羅瓊等［43］研究表明：經(jīng)過提純的枸杞多糖組分LBP－X對(duì)四氧化嘧啶糖尿病兔的降血糖效果優(yōu)于粗枸杞多糖，更優(yōu)于枸杞原汁，降糖效率達(dá)100%。孫桂菊等［44］研究了枸杞多糖和茶葉多糖（TPS）混合物對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠的控制效果，按照高（0.6g／kg·BW）、低（0.3g／kg·BW）2個(gè)劑量水平灌胃大鼠，對(duì)給藥后高、低劑量組與正常組血糖值進(jìn)行比較，結(jié)果表明：枸杞多糖、TPS混合物具有增加胰島素敏感性和肝糖原儲(chǔ)備，降低血糖水平的作用，對(duì)正常動(dòng)物血糖水平和糖耐量未見影響；該研究組［45］還研究了枸杞多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血清糖基化終產(chǎn)物－肽（AGEs－P）、糖基化血紅蛋白（HbAlc）等指標(biāo)的影響，結(jié)果表明：枸杞多糖能降低Ⅱ型糖尿病大鼠血漿HbAlc、血清AGEs－P及腎臟IL－8的含量，從而起到預(yù)防糖尿病的作用。劉磊等［46］應(yīng)用枸杞多糖灌胃以四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠，探討了枸杞多糖對(duì)糖尿病小鼠的降糖作用和對(duì)胰島B細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4周后血清胰島素（Ins）水平較治療前顯著上升，說明枸杞多糖確實(shí)改善了B細(xì)胞功能從而促進(jìn)了Ins的分泌。

枸杞多糖還可能通過提高機(jī)體SOD等抗氧化劑的活力，降低機(jī)體MDA的含量，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力及清除氧化產(chǎn)物的能力，減輕或阻止自由基對(duì)胰島β－細(xì)胞的損傷、促進(jìn)胰島β－細(xì)胞的修復(fù)與再生來(lái)實(shí)現(xiàn)其降血糖作用［47］。汪建紅等［48］通過給試驗(yàn)小鼠灌胃高（80mg／kg·BW）、中（50mg／kg·BW）、低（20mg／kg·BW）劑量的黑果枸杞果實(shí)多糖研究其降血糖功效及其機(jī)制，21d后測(cè)定試驗(yàn)小鼠血清與肝臟的超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和肝糖原水平等指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：黑果枸杞果實(shí)多糖對(duì)降低糖尿病小鼠血糖含量，增強(qiáng)血清和肝臟SOD活性，降低血清和肝臟MDA含量和促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁窃矫婢哂酗@著的效果。陳曉琴等［49］比較了枸杞多糖與抗糖藥物鹽酸二甲雙胍的降血糖作用及抗氧化能力，研究發(fā)現(xiàn)：和鹽酸二甲雙胍相比，枸杞多糖抗氧化能力較強(qiáng)而降血糖作用稍弱。低劑量組小鼠的血清SOD活力有顯著提高（P＜0.05），高劑量組血清MDA則極顯著降低（P＜0.01）。

此外，李朝暉等的細(xì)胞試驗(yàn)［50］表明，枸杞多糖具有較好的體外降血糖作用。Luo等［51］比較了枸杞果實(shí)浸出液、粗枸杞多糖和經(jīng)純化的枸杞多糖組分LBP－X對(duì)血糖的調(diào)節(jié)作用，試驗(yàn)取等量3種物質(zhì)灌胃制備好的糖尿病兔子模型，連續(xù)灌胃10d后測(cè)定血糖濃度，結(jié)果顯示枸杞浸出液、粗枸杞多糖和LBP－X均呈現(xiàn)良好的降血糖效果，其中LBP－X的降血糖作用比枸杞浸出液和粗枸杞多糖更為顯著。

3 展望

枸杞子中的多糖成分具有許多重要生理功能且無(wú)毒副作用，因此在臨床應(yīng)用和功能食品開發(fā)方面具有廣闊的應(yīng)用前景，備受國(guó)內(nèi)外研究者的青睞，但是由于枸杞多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、純化后各組分樣品量小、分析成本較高等難點(diǎn)限制了對(duì)其更深入的研究?，F(xiàn)有枸杞多糖的研究成果主要集中在提取、分離純化條件的優(yōu)化、初級(jí)結(jié)構(gòu)的表征分析以及發(fā)揮藥效的推測(cè)方面。當(dāng)前對(duì)枸杞多糖的研究需從以下幾個(gè)方面展開：① 進(jìn)一步探索并建立系統(tǒng)的綠色環(huán)保、低廉高效的提取純化方法；② 強(qiáng)化枸杞多糖低級(jí)結(jié)構(gòu)的表征分析，建立系統(tǒng)可靠的研究手段和表達(dá)方法；探索枸杞多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)的表征和描述，進(jìn)而研究枸杞多糖結(jié)構(gòu)、溶液行為與活性、功效之間的關(guān)系；③ 研究枸杞多糖發(fā)揮生理功效的作用機(jī)理，利用動(dòng)物試驗(yàn)探索枸杞多糖在體內(nèi)的降解途徑以及以何種形式、在何部位發(fā)揮其功能作用；④ 加快開發(fā)以枸杞多糖為主要成分的藥品和功能性食品。

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