楊趁仙陳復生劉昆侖布冠好郭 珍徐衛(wèi)河

YANG Chen－xian1CHEN Fu－sheng1LIU Kun－lun1BU Guan－h(huán)ao1GUO Zhen1XU Wei－h(huán)e2

（1.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.河南工業(yè)大學化學化工學院，河南 鄭州 450001）

傳統的蛋白質分離方法有沉淀法、離子交換法、吸附法等［1－3］，但缺點是工藝復雜、效率低、能耗高、有溶劑殘留等，因此難以滿足現代生化分離的需要。20世紀70年代末新興的反膠束萃取技術適用于蛋白質或酶類等大分子的分離純化，具有操作簡單、萃取率高、可連續(xù)操作、不易引起目標產物變性等優(yōu)點。近些年來，反膠束萃取技術已應用于生物［4，5］、化工、食品［6］、材料、醫(yī)藥［7］等諸多方面，具有廣闊的應用前景。文章重點介紹了反膠束萃取蛋白質的基本原理、主要影響因素及國內外有關反膠束體系萃取植物蛋白質的結構與特性的研究現狀。

1 反膠束體系的概念及萃取原理

反膠束（reverse micelle），又稱反膠團，是表面活性劑分散于連續(xù)有機相中形成的納米尺度的一種聚集體（10～100nm），反膠束溶液是透明的、熱力學穩(wěn)定的系統。

將表面活性劑添加到水或有機溶劑中，使其濃度超過臨界膠束濃度，表面活性劑就會聚集在一起，極性基團向外，與水接觸，非極性基團向內，形成一個非極性核，稱為正膠束。若將表面活性劑添加在有機溶劑中，當其濃度超過臨界膠束濃度時，表面活性劑的親水極性頭自發(fā)向內，形成一個極性核，疏水非極性尾向外，與非極性的有機溶劑接觸，形成含有極性內核的聚集體即為反膠束（見圖1）。水進入此極性內核后形成的“水池”具有增溶蛋白質、酶、氨基酸等物質的能力，增溶的過程稱為前萃（forward extraction）；將前萃液與另一水相接觸，改變水相條件（如pH值、離子種類或離子濃度等），使目標產物從反膠束轉移到水相的過程，稱為后萃（backward extraction）。常用的有機溶劑有異辛烷、正辛烷等脂肪烷烴［8］；常用的表面活性劑有丁二酸－2－乙基已基酯磺酸鈉（AOT）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、三辛基甲基氯化銨（TOMAC）等［9］。表面活性劑通常與某些有機溶劑配合使用［10］，見表1。

圖1 正常膠束與反膠束示意圖Figure1 Structure of micelle and reverse micelle

表1 反膠束萃取中常用的表面活性劑及其相應的有機溶劑Table1 Surfactant used commonly and the corresponding organic solvent of reverse micelles

2 反膠束體系表征參數

描述反膠束體系的性質通常用W0（或R）、θ和N等參數，其中W0表示形成反膠束微粒的水和表面活性劑的摩爾數比，θ（mol／L）表示增溶的水相對于有機相總體積的濃度，N表示組成反膠束微粒的表面活性的個數即聚集數。W0是衡量反膠束體系增溶能力最重要的參數，當W0一定時，θ和N決定了反膠束微粒的相對濃度。

3 影響反膠束萃取的主要因素

3.1 表面活性劑的種類

表面活性劑是形成反膠束的主要成分，它是一種由親水的極性基團和親油的非極性基團組成的兩親分子［11］，可分為陰離子表面活性劑（如AOT，DBS，SDS）、陽離子表面活性劑（如CTAB，TOMAC）、兩性離子表面活性劑（如卵磷脂）和非離子型表面活性劑（如Tween－85、烷基酚聚氧乙烯醚）。

研究［12］發(fā)現，由兩種或兩種以上表面活性劑構成的混合反膠束體系對蛋白質的提取優(yōu)于單一的反膠束體系。趙曉燕等［13］用4種表面活性劑（AOT、CTAB、TritonX－100、SDS）形成的反膠束對大豆蛋白進行提取，對水池 （W0）大小、蛋白質提取率及蛋白質亞基分子量進行了比較，得出AOT、SDS、CTAB和TritonX－100反膠束體系提取大豆蛋白質的最佳濃度分別為0.08，0.08，0.08，0.10g／mL。孫秀平等［14］研究了 AOT、SDS、CTAB和 TritonX－100表面活性劑形成的反膠束對花生蛋白提取率的影響，結果表明不同的表面活性劑形成反膠束的“水池”大小不同，導致蛋白質提取率也不同。郭珍等［15］研究發(fā)現，用AOT、SDS與異辛烷正辛醇復合反膠束體系萃取花生蛋白，不僅萃取率有所提高，萃取時間也顯著縮短，萃取效果顯著優(yōu)于單一反膠束體系。

3.2 表面活性劑的濃度

表面活性劑的濃度直接影響體系界面膜的穩(wěn)定性、反膠束基團聚集數和萃取效率。當表面活性劑濃度過低時，難以形成穩(wěn)定的反膠束微乳液；濃度過高且體系水分含量不變時，W0值變小，則反膠束尺寸減小，由于空間位阻作用使蛋白質增溶到反膠束內受阻，導致蛋白質萃取率下降；在適當的濃度范圍內，隨著表面活性劑濃度的增大，萃取率也不斷提高［16］。

任健等［17］研究了不同濃度AOT反膠束溶液對玉米胚芽蛋白前萃率的影響，結果顯示當AOT濃度增加，反膠束的W0值、水池直徑及體系相對黏度增加，蛋白質的前萃率也增加，并確定了AOT濃度為0.044g／mL時前萃率最高，但隨著AOT濃度再增加，玉米胚芽蛋白的前萃率有所下降，這可能是由于AOT濃度過高對蛋白質的增溶起到了阻礙作用。孫曉宏［18］研究了不同AOT濃度對小麥胚芽蛋白前萃率的影響，前萃率隨AOT濃度增加有顯著增加趨勢，但增加到一定程度時，趨勢有所下降最后趨于平衡。

3.3 水相pH值

水相pH值的改變直接影響蛋白質表面的電荷情況，若蛋白質表面凈電荷與表面活性劑頭部基團的電性相反，它們之間就存在靜電吸引。當水相pH小于等電點（pI）時，蛋白質帶正電，使用陰離子表面活性劑，有利于蛋白質進入反膠束中；若使用陽離子表面活性劑，則相反［10］。pH大于蛋白質的等電點時，蛋白質表面帶負電荷。

3.4 離子強度

水相中離子強度的大小決定帶電表面所賦予的靜電屏蔽程度，主要表現為降低帶電分子和反膠束帶電界面之間的靜電相互作用；降低表面活性劑頭部基團之間的靜電排斥力，使反膠束顆粒變小，W0值減小。因此，降低水相的離子強度，有利于極性物質在反膠束中的增溶［10］。

3.5 溫度

溫度也會影響反膠束的萃取率。在反膠束體系中，溫度升高，表面活性劑與水的親和力減小，導致反膠束水池直徑減小，W0值降低。溫度過高，反膠束體系不穩(wěn)定，且蛋白質也易產生變性。

此外，蛋白質的大小、濃度、表面的電荷分布及外界因素等也影響反膠束的萃取效率。

4 反膠束萃取植物蛋白質結構和特性的研究

蛋白質結構的改變對其功能特性有著直接影響，而不同的萃取環(huán)境會不同程度的改變蛋白質的結構，如溶液中離子強度、pH值等因素會使反膠束中蛋白質的結構發(fā)生改變，影響了蛋白質的二、三、四級結構［19－21］，內部結構的改變直接導致蛋白質的凝膠特性、起泡性、乳化性、持水性等功能特性的變化。目前可以用多種技術對蛋白質結構信息進行測定，如掃描電鏡、氨基酸分析儀、X射線衍射、核磁共振、紅外光譜圖、拉曼光譜分析等［22－26］。近年來，一些學者采用上述方法對反膠束萃取的植物蛋白質的結構進行研究，并與傳統的堿溶酸沉提取法提取的蛋白質對比，以探索蛋白質結構和理化特性的變化。

4.1 反膠束萃取法對植物蛋白質結構的影響

反膠束“水池”增溶蛋白質的驅動力主要包括疏水力、靜電作用以及羥基間的相互作用，這些作用都可能對蛋白質的結構變化產生重要影響［27］。此外，外界條件如pH值、離子強度等也會影響蛋白質的結構［28］。因此對反膠束萃取的植物蛋白質的結構進行研究顯得尤為重要，這也為研究萃取物的功能特性奠定了基礎。

Chang等［29］較早地利用傅里葉變換紅外光譜測定含重水的AOT／異辛烷反膠束萃取的α－胰凝乳蛋白酶的二級結構，通過紅外酰胺I帶子峰的位置和強度判斷蛋白質的二級結構的改變，也可估測反膠束萃取條件下α－胰凝乳蛋白酶不同結構的相對含量。結果表明，反膠束萃取的α－胰凝乳蛋白酶結構中α－螺旋和β－折疊比例減少，而無規(guī)則結構增多，這可能會使α－胰凝乳蛋白酶有更多的內部結構暴露出來，從而改變了酶的活性。之后，Chen等［30］采用紅外光譜技術對AOT反膠束萃取的大豆蛋白的特性進行研究，結果顯示水相萃取法與AOT反膠束萃取法得到的大豆蛋白其紅外譜圖上4 000～400cm－1處的峰強度和位置有所不同，且α－螺旋、β－折疊及不規(guī)則構象的比例均有差異，這些改變均可能影響大豆蛋白的功能特性。Zhao等［31］應用拉曼光譜對反膠束萃取大豆蛋白的主側鏈構象變化進行研究，通過與水相萃取對比發(fā)現，反膠束萃取的球蛋白分子的無序程度增加，并且出現一些新鍵；且此法萃取的7s和11s球蛋白主側鏈的構象、α－螺旋、β－折疊及規(guī)則構象所占比例也都有變化。高亞輝等［32］采用不連續(xù)SDS－PAGE和氨基酸分析對AOT／異辛烷反膠束萃取和堿溶酸沉法生產的大豆蛋白進行了組分分析，結果發(fā)現反膠束萃取小分子蛋白質的能力較強，且其中α－螺旋和β－折疊含量低于大豆分離蛋白。反膠束萃取的蛋白中天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和色氨酸的含量高于堿溶酸沉法生產的大豆分離蛋白。

總體看來，在反膠束萃取的特殊微環(huán)境下，得到的蛋白質孔徑較?。坏鞍追肿拥闹麈湹摩粒菪?、β－折疊和β－轉角結構有一定程度的減少，而無規(guī)則卷曲結構增加，側鏈基團也有微小變化；反膠束萃取對蛋白質中必需氨基酸含量的影響不大，甚至有利于提高某些氨基酸的含量，這可以改良蛋白質的功能特性。蛋白質的基團和微觀結構的改變表明反膠束體系與蛋白質發(fā)生了相互作用，如蛋白質的羥基、氫鍵與表面活性劑之間的作用，有機溶劑、蛋白質的疏水基團與表面活性劑之間的作用等，這些作用都對蛋白質的微觀結構產生了一定影響。

4.2 反膠束萃取法對植物蛋白質功能特性的影響

中國植物蛋白資源豐富、營養(yǎng)價值高，被廣泛應用于乳制品加工、肉制品中、烘焙食品及面制品中、罐頭食品、飲料生產和保健食品等行業(yè)［33，34］。對反膠束萃取法分離的植物蛋白質的功能特性進行研究，有利于改善植物蛋白在生產應用中的穩(wěn)定性、乳化性、發(fā)泡性等性能，提高其營養(yǎng)價值、消化利用率和保健功效，更好地滿足消費者的需求。

陳復生等［35］分別用超聲輔助 AOT／異辛烷反膠束、AOT／異辛烷反膠束和堿溶酸沉法提取大豆蛋白，并研究了其功能性差異。結果表明超聲輔助反膠束萃取的大豆蛋白不僅蛋白質含量高，且持水性、起泡性及其穩(wěn)定性、乳化性及其穩(wěn)定性均優(yōu)于其他兩種蛋白，但溶解性略低于AOT／異辛烷反膠束萃取的大豆蛋白。通過電子顯微鏡掃描儀觀察發(fā)現3種蛋白的微觀結構均不相同，表明在反膠束和超聲波的特殊環(huán)境中，蛋白質微觀結構發(fā)生了變化，從而影響了其功能性質。Zhu等［36］在研究反膠束萃取的脫脂小麥胚芽蛋白的功能特性時指出，分離的小麥胚芽蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性高于蛋清標準，是一種高潛力蛋白，有望成為雞蛋蛋白的廉價替代品。

4.3 反膠束萃取法對植物蛋白質物理性質的影響

食品加工過程中，蛋白質受熱內部氫鍵斷裂，會導致蛋白質分子展開，這個過程需要吸熱，稱之為變性熱。蛋白質分子變性過程會伴隨著能量的變化，差示掃描量熱法（DSC）可以對其進行測量［37］。因此，研究反膠束萃取的植物蛋白質的熱特性和流變學特性對其功能特性的分析以及進行工業(yè)生產的應用提供了重要依據。

Zhao等［38］用DSC分析了兩種萃取方法（AOT反膠束萃取、水相萃?。┇@得的7s、11s球蛋白熱特性和流變學特性，結果發(fā)現兩者萃取的7s、11s的變性溫度和轉變焓與水相萃取的均不相同。AOT反膠束萃取法不影響11s的凝膠特性，但7s受到影響。反膠束萃得的7s球蛋白的硬度、彈性、粘附性和咀嚼性均低于傳統水溶液萃取的，但膠黏性稍高。李飛等［39］用DSC對反膠束萃取玉米胚芽蛋白熱特性進行研究發(fā)現，蛋白質在吸熱過程中，分子結構由有序變?yōu)闊o序，熱變性溫度和變性焓較高，說明反膠束萃取的蛋白質結構緊密，穩(wěn)定性好。與傳統的蛋白質分離方法相比，反膠束體系萃取的蛋白質并沒有發(fā)生較大的變性，根據萃取的蛋白種類不同，其凝膠性、咀嚼性、彈性、粘附性等受到了一定程度的影響。研究萃取蛋白的熱特性和流變學特性對其應用于食品工業(yè)生產中有著重要意義，不僅可以提高資源利用率，還可以改善產品風味口感，增加營養(yǎng)價值［40］。

5 結束語

反膠束萃取技術在植物蛋白質的提取方面具有顯著優(yōu)勢，而且具有廣闊的應用前景。但反膠束萃取技術由于條件限制，尚未實現工業(yè)化生產，而且萃取過程中還存在一些問題亟待克服：① 有機溶劑和表面活性劑仍有殘留，需研究開發(fā)一種天然安全的新型反膠束體系，以滿足工業(yè)生產安全性的要求；②反膠束萃取引起植物蛋白質結構變化的原因尚不明確，需進一步研究萃取物的微觀結構和特性，并與傳統方法對比分析反膠束萃取法的優(yōu)劣；③ 反膠束萃取的傳質模型仍未確定，需深入研究反膠束萃取過程提出傳質模型并驗證。以上問題的解決有助于提高反膠束萃取效率，優(yōu)化反膠束萃取工藝，為植物蛋白質的提取提供一種重要方法，也為反膠束萃取技術實現工業(yè)化生產提供堅實的理論依據。

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