盧莉娜， 趙偉春， 沈嬋娟， 郭 偉

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053)

湖州鐵線蓮Clematis huchouensis Tomura，藥名金剪刀，為雙子葉植物藥毛茛科植物湖州鐵線蓮的全草［1］，辛、咸、溫，入肝、膀胱經(jīng)［2］，別名河邊威靈仙、吳興鐵線蓮(《杭州藥用植物名錄》)。鐵線蓮屬植物作為藥用已有很長歷史，我國中醫(yī)臨床和民間常用于利尿通淋、祛風(fēng)止痛。自20世紀(jì)70年代開始，已開展對鐵線蓮及其同屬近緣植物的化學(xué)成分研究，迄今為止，從中分離出三萜皂苷、木脂素、黃酮、香豆素、生物堿、酚性成分和糖酯等多種成分［3］。三萜皂苷類成分為齊墩果酸或常春藤皂苷元的衍生物，因其所結(jié)合的糖數(shù)目及種類不同而異，是鐵線蓮的主要化學(xué)成分，且含量豐富［4］，生物活性多樣，幾乎無毒副作用，在臨床上具有廣泛用途和良好療效?，F(xiàn)代研究表明具有明顯的抗炎、護(hù)肝、抗腫瘤以及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。國內(nèi)、外學(xué)者對該屬植物的藥理作用進(jìn)行了較多的實驗研究，一些品種已經(jīng)做成制劑用于臨床治療。

大孔吸附樹脂在上世紀(jì)70年代末開始應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的提取分離，1979年中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所植化室報道大孔樹脂［5］可用于三棵針生物堿、赤芍苷、天麻苷、薄蓋靈芝中尿嘧啶與尿嘧啶核苷的分離。它對糖類的吸附能力很差，對色素的吸附能力較強(qiáng)，對皂苷、黃酮亦有很強(qiáng)的吸附作用［6］。利用大孔吸附樹脂的多孔結(jié)構(gòu)和選擇性吸附功能可從中藥提取液中分離精制有效成分或有效部位，最大限度地去粗取精。根據(jù)桂雙英等［7］、吳方暉等［8］研究發(fā)現(xiàn)，D101和 AB-8樹脂是在分離皂苷類物質(zhì)中使用率較高、效果較好的兩種樹脂。通過比較不同樣品上樣量下D101和AB-8兩種大孔吸附樹脂對總皂苷的吸附率和解析率，能夠找出分離能力更好的樹脂，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 原料

湖州鐵線蓮于2008年7月初采自浙江湖州，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院姚振生教授鑒定為中藥湖州鐵線蓮 (吳興鐵線蓮);D101大孔吸附樹脂(天津農(nóng)藥股份有限公司)、AB-8大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司);齊墩果酸 (中國藥品生物制品鑒定所)。

1.2 試劑

95%工業(yè)酒精;石油醚、冰醋酸、高氯酸、香草醛為分析純。

1.3 儀器

TU1900雙光束紫外可見分光光度計 (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海生申科技有限公司);FZ102微型植物試樣粉碎機(jī) (天津市泰斯利儀器有限公司);恒溫水浴鍋 (金壇市大地自動化儀器廠);DZF—6050型真空干燥箱 (上海博訊實業(yè)有限公司)。

2 方法

2.1 湖州鐵線蓮的乙醇提取

新鮮的湖州鐵線蓮葉和莖，置于鼓風(fēng)干燥箱中56℃恒溫烘干至恒定質(zhì)量，粉碎，取100 g粉末于圓底燒瓶中，以1∶5(kg/L)的比例加入石油醚，70℃回流脫脂2次，每次1 h，過濾后將殘渣風(fēng)干。向風(fēng)干后的殘渣中加入8倍量的80%乙醇，浸泡過夜，在85℃回流提取2次，每次1 h。用四層紗布過濾，合并3次回流所得藥液，濾液濃縮至無醇味，再放入真空干燥箱中干燥至恒定質(zhì)量，即得湖州鐵線蓮浸膏。稱取2.843 g浸膏，加入蒸餾水定容至500 mL，配制成5.686 g/L的湖州鐵線蓮乙醇提取物樣品溶液，備用。

2.2 湖州鐵線蓮總皂苷的測定

2.2.1 最大波長的選擇 精密稱取10.00 mg齊墩果酸對照品，用甲醇溶解定容至10 mL量瓶。分別吸取0.0、20.0μL溶液于10 mL的具塞試管中，真空干燥隔夜蒸干溶劑。分別加入0.2 mL 5%香草醛－冰醋酸 (新鮮配制)和0.8 mL高氯酸進(jìn)行顯色，70℃水浴加熱15 min，取出后立即用流水冷卻3 min，然后加入5 mL冰醋酸稀釋，以空白溶液為參比溶液，搖勻后全波長掃描，得出齊墩果酸對照品的最大吸收波長。

2.2.2 皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確量取0.0、20、40、60、80、100μL對照品溶液，蒸干溶劑后顯色方法如上所述，以空白溶液為參比溶液，于最大吸收波長處測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 湖州鐵線蓮總皂苷的測定方法 取湖州鐵線蓮乙醇提取物樣品溶液1 mL和0 mL于10 mL具塞試管中，其中0 mL為空白溶液。根據(jù)2.2.1項的方法，于最大吸收波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算湖州鐵線蓮樣品的皂苷的量。

2.3 D101和AB-8樹脂對湖州鐵線蓮總皂苷吸附能力的比較研究

2.3.1 上樣量對總皂苷吸附率的影響 1)吸附:取D101和AB-8樹脂各5份，每份折合成干樹脂1.0 g(其中1.9 g D101濕樹脂烘干后為1.0 g D101干樹脂;3.0 g AB-8濕樹脂烘干后為1.0 g AB-8干樹脂)于錐形瓶，加入湖州鐵線蓮乙醇提取物樣品溶液各5、10、15、20、25 mL于10個錐形瓶中，密封瓶口，并置于搖床上120 r/min震蕩，靜止吸附20 h。用移液槍吸取經(jīng)樹脂吸附后的溶液用于測定皂苷的濃度。樹脂用去離子水沖洗至無色后進(jìn)行真空抽濾，備用。

2)吸附后溶液皂苷的測定:取一定體積的上述經(jīng)樹脂吸附后的溶液于10 mL的具塞試管中，其中0 mL為空白溶液。根據(jù)2.2.1項的方法，于最大吸收波長處測定吸光度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算湖州鐵線蓮樣品的皂苷的量。

2.3.2 上樣量和乙醇體積分?jǐn)?shù)對總皂苷解析率的影響 采用兩種方法對經(jīng)靜態(tài)吸附了湖州鐵線蓮乙醇提取物的D101和AB-8樹脂進(jìn)行解析。1)分步洗脫:取上述經(jīng)靜態(tài)吸附了湖州鐵線蓮乙醇提取物的D101和AB-8樹脂各5份。分步加入體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%的乙醇溶液，用量依次對應(yīng)為 5、10、15、20、25 mL，120 r/min震蕩解析20 h。

2)一次性洗脫:取上述經(jīng)靜態(tài)吸附的D101和AB-8樹脂各5份，去掉上層溶液。一次性加入50%，70%，95%的乙醇溶液，乙醇溶液的用量依次對應(yīng)為5、10、15、20、25 mL，120 r/min震蕩解析20 h。

2.3.3 上樣量和乙醇體積分?jǐn)?shù)對總皂苷提取率的影響 計算并比較D101和AB-8樹脂對皂苷提取率。

3 結(jié)果與分析

3.1 皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)紫外分光光度計掃描，可見齊墩果酸在548 nm處有最大吸收峰。經(jīng)擬合，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.02～0.100 mg范圍內(nèi)，吸光度與齊墩果酸質(zhì)量呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=0.114 5X+0.006 8，R=0.999 4。式中Y為齊墩果酸質(zhì)量，X為吸光度。

3.2 上樣量對總皂苷吸附能力的影響

3.2.1 不同上樣量下D101和AB-8樹脂對總皂苷吸附能力的比較 實驗結(jié)果見圖1、2。D101樹脂和AB-8樹脂對湖州鐵線蓮皂苷的吸附量隨著上樣量的增加而增加，而吸附率則隨著上樣量的增加而減少。AB-8樹脂在不同上樣量下對皂苷的吸附量都較D101樹脂大，吸附效果較好。

圖1 不同上樣量下D101和AB-8樹脂對皂苷吸附量的比較Fig.1 Comparison on the adsorption quantity of D101 and AB-8 resin on saponins in different sample volumes

圖2 不同上樣量下D101和AB-8樹脂對皂苷吸附率的比較Fig.2 Comparison on the adsorption rate of D101 and AB-8 resin on saponins in different sam p le volumes

3.2.2 不同上樣量下D101和AB-8樹脂對乙醇分步洗脫總皂苷解析率的比較 在用低體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫的情況下，D101和AB-8樹脂對皂苷的解析能力差別不大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，AB-8樹脂的解析能力明顯優(yōu)于D101樹脂 (如圖3、圖4和圖5)。因此在一次性洗脫時僅選用AB-8樹脂進(jìn)行實驗。

圖3 D101和AB-8樹脂30%乙醇洗脫解析率的比較Fig.3 Comparison on the resolution rate of D101 and AB-8 resin on saponins eluted with 30%ethanol

圖5 D101和AB-8樹脂50%乙醇洗脫解析率的比較Fig.5 Comparison on the resolution rate of D101 and AB-8 resin on saponins eluted with 50%ethanol

圖6 D101和AB-8樹脂70%乙醇洗脫解析率的比較Fig.6 Comparison on the resolution rate of D101 and AB-8 resin on saponins eluted with 70%ethanol

3.2.3 不同上樣量下AB-8樹脂對乙醇一次洗脫總皂苷解析率和提取率的比較 由圖6、7可知，隨著單位質(zhì)量的樹脂處理的樣品量增大，相同體積分?jǐn)?shù)乙醇對總皂苷的解析率和提取率均不斷增大，當(dāng)樹脂的上樣量比為1∶20時，解析率和提取率均達(dá)最大值。當(dāng)樹脂的上樣量一定時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，皂苷的解析率和提取率亦逐漸增大。由于當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過大時一些吸附在樹脂上的非極性成分很容易被洗脫下來，會降低皂苷的純度，同時考慮到乙醇用量和后續(xù)工藝中濃縮的工作量，因此，篩選出皂苷靜態(tài)吸附最佳提取條件為樹脂的上樣量比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。

圖6 AB-8樹脂靜態(tài)吸附乙醇一次性洗脫解析率比較Fig.6 Comparison on the resolution rate of saponins statically adsorbed by AB-8 resin and disposable eluted with ethanol

圖7 AB-8樹脂靜態(tài)吸附乙醇一次性洗脫提取率比較Fig.7 Comparison on the extraction rate of saponins statically adsorbed by AB-8 resin and disposab le eluted with ethanol

4 討論

4.1 植物的乙醇提取物中含有皂苷、黃酮和色素等多種成分。目前，對鐵線蓮屬植物皂苷類成分的研究報道比較多，其次為黃酮類成分［3］，木脂素類等成分的研究報道較少［9］。鐵線蓮屬植物中威靈仙含原白頭翁素及以常春藤皂苷元、表常春藤皂苷元和齊墩果酸為苷元的皂苷［10］。但湖州鐵線蓮屬植物中皂苷的提取分離及其組成尚未見報道。國內(nèi)外有關(guān)對湖州鐵線蓮中黃酮類化合物提取分離純化工藝及生理活性的報道也不多。僅見浙江大學(xué)藥學(xué)院利用高效液相色譜法比較了分別采自杭州和浙江湖州鐵線蓮8個組分的含有量差異［11］。

4.2 實驗結(jié)果表明，D101樹脂和AB-8樹脂對皂苷均有極好的吸附能力，兩者的解析率亦隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高而提高，其中AB-8樹脂對湖州鐵線蓮乙醇提取物中皂苷的吸附能力和乙醇的解析能力均優(yōu)于D101樹脂。其原因可能是因為大孔吸附樹脂是通過物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機(jī)物，而AB-8樹脂顆粒較細(xì)小，因而具有更大的比表面積，等量的樹脂擁有更大的吸附量。因此，篩選了AB-8樹脂對湖州鐵線蓮乙醇提取物進(jìn)行吸附和解析，去除了湖州鐵線蓮乙醇提取物中不易被大孔樹脂吸附的其它成分。但是，AB-8樹脂對湖州鐵線蓮黃酮亦具有較好的吸附能力，如何將湖州鐵線蓮乙醇提取物中的皂苷進(jìn)一步分離純化出來還有待于進(jìn)一步研究。

［1］侯寬昭．中國種子植物科屬詞典［M］(第2版)．北京:科學(xué)出版社，1998．

［2］宋志宏，趙玉英，段京莉．鐵線蓮屬植物的化學(xué)成分及藥理作用研究概況［J］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1995，7(2):66-67．

［3］Dong C X，Wu K S，Shi S P，et al．Flavonoids from Clematis hexapetala［J］．J Chin Pharm Sci，2006，15(1):15-20．

［4］Ma X L，Xie L，Liu L F，et al．Simultaneous quantification of seven main triterpenoid saponins in Radix et Rhizoma Clematidis by LC －ELSD［J］．Chromatographia，2009，69(5):437．

［5］徐先祥，夏倫祝，高家榮．大孔吸附樹脂在皂苷分離純化中的應(yīng)用［J］．中國中醫(yī)藥信息雜志，2003，10(1):79-80．

［6］徐先祥，夏倫祝．大孔吸附樹脂分離純化威靈仙總皂苷的工藝研究［J］．中藥新藥與臨床藥理，2006，17(1):57-59．

［7］桂雙英，周亞球，柯仲成．D 101型樹脂對芍藥苷吸附分離性能的研究［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2006，12(2):25-27．

［8］吳方暉，李文亮，邊鳴鏑．AB-8大孔吸附樹脂純化大豆甙的研究［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004(3):94-96．

［9］黃文武．鐵線蓮屬植物的研究進(jìn)展［J］．中草藥，2002，33(3):285-288．

［10］徐小云，王云霞，李智勇．威靈仙化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］．現(xiàn)代中醫(yī)藥，2003，23(4):67．

［11］Chaudhary M I，Qing H，Xiao PG，et al．Clematishuchouensis Tamura:A traditional Chinese herbal medicine and its quality control using a high performance liquid chromatography technique［A］．Biol Pharm Bull，2007，30(1):165-168．