牟英迪， 林吉茂

(1．濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南250001;2．山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東濟(jì)南250100)

牛黃上清丸屬于國(guó)家基本藥物目錄品種，具有清熱瀉火、散風(fēng)止痛的功效。其中牛黃上清丸由全粉入藥，已應(yīng)用于臨床多年，其標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2010年版［1］。牛黃上清丸中，連翹具有涼散風(fēng)熱，清熱解毒的功效，其指標(biāo)成分為連翹苷［2］;黃芩、黃連、黃柏，具有苦寒的性味，都以清熱瀉火解毒的功效著稱(chēng)。根據(jù)中醫(yī)理論，復(fù)方中藥藥效的效果是各味藥材多種組分共同作用的結(jié)果，各成分的含有量多少及比例關(guān)系都會(huì)影響整體藥效，影響治療效果［3］。牛黃上清丸由十九味中藥組成，而在《中國(guó)藥典》2010年版一部中，在含量測(cè)定項(xiàng)下僅對(duì)黃芩苷進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)測(cè)定黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿的量能更好地表征牛黃上清丸的質(zhì)量。HPLC程序波長(zhǎng)法具有測(cè)定誤差小特點(diǎn)，已得到廣泛應(yīng)用［4-7］。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC程序波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定牛黃上清丸中黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿量，可以節(jié)約能源，并有效提高檢測(cè)效能，減少分析誤差，以期控制其質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫高效液相色譜儀Agilent1200，VWD檢測(cè)器;UV—2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津);梅特勒AE—240型電子分析天平 (十萬(wàn)分之一);SK2200LH超聲波清洗器 (上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 甲醇、乙腈 (天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，色譜純);水為重蒸餾水;其余試劑均為分析純;黃芩苷 (批號(hào) 110715-200514，純度94.0%)、連翹苷 (批號(hào) 110821-200711，純度98.9%)和鹽酸小檗堿 (批號(hào)110713-200208，純度86.8%)均為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。黃連上清丸 (同仁堂股份公司制藥廠，批號(hào)為:2015274、2015207、2015049)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Zorbax XDB-C18色譜柱 (5μm，250 mm×4.6 mm)，以乙腈 (A)-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液 (B)為流動(dòng)相按表1進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相體積流量1.0 mL/min，柱溫25℃;進(jìn)樣量5μL;程序可變檢測(cè)波長(zhǎng)為0～10 min為278 nm，10～20 min為 230 nm，20～55 min為265 nm。

表1 流動(dòng)相梯度程序Tab.1 M obile phase gradient elution program

在此檢測(cè)條件下，黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿均得到較好分離，理論塔板數(shù)按黃芩苷計(jì)算不低于5 300、按連翹苷計(jì)算不低于8 100、按鹽酸小檗堿計(jì)算不低于3 200。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

2.2.1 黃芩苷 精密稱(chēng)取黃芩苷對(duì)照品11.91 mg(純度94.0%)置50 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為223.9μg/mL的黃芩苷對(duì)照品貯備溶液。

2.2.2 連翹苷 精密稱(chēng)取連翹苷對(duì)照品9.00 mg(純度98.9%)置100 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為89.01 μg/mL的連翹苷對(duì)照品貯備溶液。

2.2.3 鹽酸小檗堿 精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品9.42 mg(純度86.8%)置100 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為81.77μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備溶液。

精密量取黃芩苷對(duì)照品貯備溶液、連翹苷對(duì)照品貯備溶液和鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備溶液4 mL，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，得到黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿對(duì)照品HPLC圖，見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances

2.3 供試品溶液的制備 將牛黃上清丸大蜜丸剪碎，稱(chēng)取1.0 g置蒸餾瓶中，精密加稀乙醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，置水浴上回流3 h，放冷，稱(chēng)定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)充丟失的溶劑量，靜置，取上清液，即得供試品溶液。按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，得到牛黃上清丸樣品HPLC圖，見(jiàn)圖2。

圖2 牛黃上清丸樣品HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of Niuhuang Shangqing Pills sam ple solution

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方配比，制備不含黃芩、連翹、黃連和黃柏的陰性對(duì)照，按2.3項(xiàng)下方法，制得陰性對(duì)照溶液并按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

圖3 陰性對(duì)照溶液HPLC圖譜Fig.3 HPLC chrom atogram of blank sam p le solution

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取黃芩苷對(duì)照品貯備溶液、連翹苷對(duì)照品貯備溶液和鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備溶液1、2、4、6、8 mL，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，按上述色譜條件測(cè)定，記錄保留時(shí)間和峰面積，以質(zhì)量濃度C與其相應(yīng)的峰面積A求得回歸方程與相關(guān)系數(shù)。結(jié)果黃芩苷的線性方程為A=3 286.7C+107.12，r2=0.998 9，黃芩苷在8.956～71.65μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;連翹苷的線性方程為A=899.2C+543.52，r2=0.999 2，連翹苷在14.242～113.93μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;鹽酸小檗堿的線性方程為A=3 250.20C+212.6，R2=0.998 2，鹽酸小檗堿在3.270～26.17μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 精取黃芩苷對(duì)照品貯備溶液、連翹苷對(duì)照品貯備溶液與鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備溶液各6 mL置同一25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)樣6次 (n=6)，黃芩苷峰面積RSD為0.83%;連翹苷峰面積RSD為0.56%;鹽酸小檗堿峰面積RSD為1.2%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取牛黃上清丸同一批號(hào)(2015207)供試品溶液5μL，分別于配制后0、2、6、12、24 h后進(jìn)樣測(cè)定，觀察供試品溶液穩(wěn)定性，樣品中黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿的峰面積積分值基本穩(wěn)定不變，黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.72%、0.63%和0.86%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按2.3項(xiàng)下所用方法配制同一批次 (2015274)供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件記錄峰面積。測(cè)得樣品中黃芩苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.93 mg/g，RSD為0.68%;連翹苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.33 mg/g，RSD為0.52%;鹽酸小檗堿峰平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.63 mg/g，RSD為0.82%，結(jié)果表明測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收率法。取已知含有量的同一批次 (2015274)樣品6份，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，分別加入質(zhì)量濃度為223.9 μg/mL的黃芩苷對(duì)照品貯備溶液、質(zhì)量濃度為356.04μg/mL的連翹苷對(duì)照品貯備溶液和質(zhì)量濃度為81.77μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備溶液各適量，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法回收性良好。見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests(n=6)

2.10 檢測(cè)限 以色譜峰峰高為基線噪音3倍計(jì)算，黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿的最低檢測(cè)質(zhì)量濃度分別為0.8、0.16、0.03μg/mL，滿(mǎn)足分析方法的要求。

2.11 定量限 以色譜峰峰高為基線噪音10倍計(jì)算，黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿的最低檢測(cè)質(zhì)量濃度分別為2.6、0.53、0.1μg/mL，滿(mǎn)足分析方法的要求。

2.12 樣品測(cè)定 取牛黃上清丸樣品3批，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿的量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿的量 (n=3)Tab.3 Contents of baicalin，phillyrin and berberine hydrochloride(n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)成分的選擇 在牛黃上清丸中，連翹為臣藥具有涼散風(fēng)熱，清熱解毒的功效，其指標(biāo)成分為連翹苷［8］。而黃芩、黃連與黃柏同為佐藥，俗稱(chēng)“三黃”，善清三焦之火［9］。其中黃芩的有效成分為黃芩苷，黃連與黃柏中的有效成分為小檗堿(通常以鹽酸小檗堿計(jì))［10-11］。尚未有文獻(xiàn)測(cè)定牛黃上清丸中的連翹苷，也未有文獻(xiàn)報(bào)道采用程序可變波長(zhǎng)HPLC法同時(shí)測(cè)定黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿的量。因此選擇牛黃上清丸中4種藥材的3種指標(biāo)成分建立定量測(cè)定方法，用于表征和評(píng)價(jià)牛黃上清丸的質(zhì)量。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 為保證各指標(biāo)成分均有適宜的靈敏度，取黃芩苷對(duì)照品溶液與鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液在200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，黃芩苷在278 nm、316 nm波長(zhǎng)處有最大吸收;連翹苷在230 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收;鹽酸小檗堿在235 nm、265 nm與345 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。采用程序可變檢測(cè)波長(zhǎng)法，分別在其最大吸收波長(zhǎng)處(278 nm與265 nm)，用高效液相色譜儀對(duì)黃芩苷、連翹苷與鹽酸小檗堿進(jìn)行梯度洗脫，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃芩苷、連翹苷與鹽酸小檗堿的回收率良好。

3.3 流動(dòng)相與與洗脫梯度的選擇 牛黃上清丸為中藥復(fù)方制劑，有效成分眾多，且黃芩苷、連翹苷與鹽酸小檗堿的化學(xué)性質(zhì)差異較大，采用等度洗脫所獲得的色譜分離效果不理想，要使各峰達(dá)到基線分離須采用二元梯度洗脫。在試驗(yàn)中采用了多種洗脫方法，如用甲醇-水-磷酸 (40∶60∶0.2)為流動(dòng)相［1］，發(fā)現(xiàn)黃芩苷與連翹苷峰型較好，但鹽酸小檗堿拖尾嚴(yán)重，分析其原因，鹽酸小檗堿為季銨堿 (pKa=11.5)，在流動(dòng)相中主要以陽(yáng)離子形式存在，易與固定相中酸性硅羥基結(jié)合而較難洗脫，形成拖尾。當(dāng)在流動(dòng)相中加入適量十二烷基磺酸鈉后，鹽酸小檗堿的保留時(shí)間明顯縮短，峰形也得到改善;但柱平衡時(shí)間長(zhǎng)，而且分析物保留時(shí)間不穩(wěn)定［12-15］。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入磷酸二氫鉀溶液保留時(shí)間更穩(wěn)定，因此改用乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用此方法洗脫，峰型漂亮，分離度好，重復(fù)性佳。

3.4 耐用性試驗(yàn) 分別用色譜柱Zorbax XDB-C18、Diamaisl C18(250 mm×4.6 mm，5μm)在兩臺(tái)高效液相色譜儀 (Agilent1200、島津)進(jìn)行了耐用性試驗(yàn)考察，結(jié)果表明，選用的2個(gè)廠家的儀器和兩種色譜柱均可滿(mǎn)足測(cè)定要求。

本實(shí)驗(yàn)以HPLC程序可變波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定牛黃上清丸中黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿的量，方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，重復(fù)性好，在有效測(cè)定黃芩苷含有量的同時(shí)也對(duì)連翹中的指標(biāo)成分連翹苷、黃柏與黃連中指標(biāo)成分鹽酸小檗堿的量進(jìn)行測(cè)定，更有利于牛黃上清丸質(zhì)量控制，可為制定牛黃上清丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供科學(xué)的依據(jù)。

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