王 雄， 陳永剛， 劉新國， 李居怡， 鄒吉利， 吳金虎

(武漢市第三醫(yī)院藥學部，湖北武漢430060)

高泌乳素血癥 (Hyperprolactinemia)，是一種常見的下丘腦-垂體-性腺軸疾患，是由于多種因素引起垂體前葉嗜酸性細胞分泌過多的泌乳素 (＞25 ng/mL)所致，大部分為女性發(fā)病，臨床上以溢乳、閉經(jīng)、月經(jīng)稀少及不孕等癥狀常見［1］。高泌乳素血癥的發(fā)生與體內(nèi)泌乳素、雌激素、孕激素等水平異常有關(guān)，部分高泌乳素血癥患者伴有乳腺增生癥狀。目前治療高泌乳素血癥的藥物主要是進口藥溴隱亭等，但其存在價格昂貴、副作用大等特點，患者依從性很差，很難堅持治療。中醫(yī)藥在治療高泌乳素血癥方面具有很大的優(yōu)勢，尤其是中藥復方治療該病取得了滿意的療效［2］。回乳抑增一號是我院應用多年的院內(nèi)制劑，由麥芽、牡蠣、浙川貝、夏枯草、白芥子、山慈姑、淡昆布、郁金、玄參、丹參等組成，具有回乳消脹、軟堅散結(jié)等功效，治療婦女溢乳，臨床應用療效顯著。本研究采用大鼠高泌乳素血癥模型，觀察其對大鼠高泌乳素血癥的治療作用，探討其作用機制，為其臨床應用及新藥開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 雌性未孕Wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，購于湖北省實驗動物研究中心，許可證號SCXK(鄂)2008-0005。

1.2 儀器與試藥 雌二醇、孕酮、泌乳素、促卵泡激素、促黃體生成素ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒 (上海麗臣生物有限公司，批號:08/2011)，恒溫箱 (武漢大江電器儀表廠)，酶標儀 (深圳雷杜Rayto RT—6000)，全自動雷杜Rayto洗板機 (RT—3100)。

甲磺酸溴隱亭:Novartis Pharma Schweiz AG生產(chǎn)，批號:10080;鹽酸甲氧氯普胺注射液 (徐州萊恩藥業(yè)有限公司，批號:1006131)。回乳抑增一號處方組成:麥芽120 g、夏枯草20 g、玄參5 g、浙川貝10 g、郁金10 g、丹參10 g、白芥子8 g、淡昆布5 g、牡蠣10 g、山慈姑3 g，藥材由湖北清大藥業(yè)公司提供，經(jīng)武漢市第三醫(yī)院藥學部吳金虎教授鑒定，各藥材品種均符合2010版《中國藥典》規(guī)定。復方制備方法:藥材加8倍量的水浸泡60 min，用武火煮沸15 min，后用文火煮30 min，取煎液。藥渣再用8倍量的水重復煎煮1次。兩次煎液合并，濾過，濃縮至2.51 g/mL(每1 mL藥液相當于2.51 g生藥量)，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2 實驗方法

2.1 模型制備 參考文獻方法［3］并加以改進，在大鼠背部皮下按50 mg/kg體質(zhì)量的劑量注射鹽酸甲氧氯普胺注射液(滅吐靈)，每天9∶00和16∶00分別注射1次，連續(xù)5 d。

2.2 分組與給藥 60只大鼠隨機分為6組:正常組、模型組、溴隱亭陽性藥組、回乳抑增一號低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，除正常組外，其他組別大鼠均制備成疾病模型，模型制備后給藥。用藥劑量根據(jù)人和動物體表面積與劑量換算［4］。陽性藥組給溴隱亭，劑量為0.393 mg/(kg·d);回乳抑增一號高劑量組給予回乳抑增一號湯劑，劑量為33.1 g/(kg·d)(人臨床劑量的11倍);回乳抑增一號中劑量組給予回乳抑增一號湯劑，劑量為16.55 g/(kg·d)(人臨床劑量的5.5倍);回乳抑增一號低劑量組給予回乳抑增一號湯劑，劑量為8.28 g/(kg·d)(人臨床劑量的2.75倍)。正常組和模型組給等容量的蒸餾水。各組動物在造模成功后，胃飼相應藥物或蒸餾水，每日1次，每次2 mL，連續(xù)30 d。

2.3 樣品采集 末次給藥24 h后，所有動物禁食12 h，自由飲水。于次日上午8∶00～10∶00取血。取血方法為眼球摘除法:倒持固定大鼠，按住頸部，使眼球突出;以小止血鉗迅速鉗取眼球，眼眶內(nèi)很快流出血液;同時作規(guī)律性松緊擠壓胸腔，以促使血液流出;血液以3 000 r/min的速度離心5 min，取上清液供檢測。

所有大鼠處死后，取第2對乳腺組織，用10%甲醛溶液充分固定24 h，標本取材后，放入生物組織自動脫水機內(nèi)脫水，浸蠟后，在生物組織包埋機內(nèi)包埋。每組組織蠟塊在切片機上連續(xù)切片3張，切成4μm厚度。

2.4 樣品檢測

2.4.1 動物一般活動觀察 觀察正常組、造模組和各給藥組大鼠的一般活動情況。

2.4.2 大鼠血清激素檢測 采用酶聯(lián)免疫分析方法檢測各組大鼠血清中雌二醇、孕酮、泌乳素、促卵泡激素、促黃體生成素的水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書中實驗操作流程進行。

2.4.3 大鼠乳腺組織形態(tài)學檢查 大鼠乳腺組織經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察各組大鼠乳腺組織情況，包括腺泡、小葉是否增生，導管形狀及厚度，以及是否出現(xiàn)分泌物。

3 結(jié)果

3.1 對動物一般活動的影響 正常組大鼠飲食、飲水正常，糞粒正常，不帶黏液;眼睛鮮紅有精神，運動快速有力。造模后大鼠飲食、飲水量減少、大便稀;眼睛無神欲閉，精神萎靡，反應遲鈍，行動遲緩，夜間自主活動減少。陽性藥溴隱亭組大鼠治療后，飲食、飲水有所改善，行動仍然遲緩?；厝橐衷鲆惶柛?、中劑量組大鼠飲食、飲水量佳、糞粒正常;毛發(fā)潤澤、眼睛鮮紅有精神，活動靈敏?；厝橐衷鲆惶柕蛣┝拷M大鼠飲食、飲水量好轉(zhuǎn)，精神不佳。

3.2 對大鼠血清激素水平的影響 由表1可見，與正常組比較，模型組大鼠血清泌乳素水平明顯升高 (P＜0.05)，雌二醇、孕酮、促卵泡激素和促黃體生成素值明顯下降(P＜0.05)。與疾病模型組相比，回乳抑增一號高劑量組和中劑量組大鼠血清泌乳素水平明顯下降，有顯著差異(P＜0.05)，且高劑量組接近正常組水平，療效與溴隱亭相當。回乳抑增一號中劑量組與模型組相比，雌二醇、孕酮、促卵泡激素和促黃體生成素水平顯著提高，均接近正常組水平，治療效果最好。回乳抑增一號低劑量組無明顯效果。

3.3 對大鼠乳腺組織病理形態(tài)的影響 乳腺增生根據(jù)病理增生狀況分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 5個等級［5］，分級標準見表2。

顯微鏡下觀察可見，正常組大鼠乳腺小葉不增生，腺體數(shù)量極少，腺泡和導管無增生、擴張，無分泌物，處于靜止狀態(tài) (見圖1A);高泌乳素血癥模型大鼠均發(fā)現(xiàn)乳腺小葉部分增生，個別腺泡和導管輕度增生，存在少量分泌物，出現(xiàn)輕度乳腺增生 (Ⅰ級或Ⅱ級增生)(見圖1B和1C);溴隱亭陽性藥組大鼠乳腺腺泡及小葉部分增生，導管擴張，可見分枝，腔內(nèi)有少許分泌物 (見圖1D);回乳抑增一號高、中劑量組大鼠乳腺腺泡恢復正常，分布均勻，大多數(shù)導管細長，分枝少，無分泌物 (見圖1E和1F);回乳抑增一號低劑量組大鼠乳腺小葉部分增生個別腺泡和導管輕度增生，存在分泌物 (見圖1G)。

表1 回乳抑增一號對高泌乳素血癥大鼠雌二醇、孕酮、泌乳素、促卵泡激素、促黃體生成素水平的影響 (n=10)

表2 乳腺組織病理增生狀況分級

圖1 各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)圖 (HE×200)

對每只大鼠的乳腺增生狀況按表2標準進行分級，結(jié)果經(jīng)Ridit檢驗，陽性藥溴隱亭組、回乳抑增一號高和中劑量組與模型組比較有顯著性差異 (P＜0.05)，有明顯的治療作用，見表3。

表3 回乳抑增一號對高泌乳素血癥大鼠乳腺組織病理形態(tài)的影響

4 討論

目前，制備高泌乳素血癥的動物模型方法的報道很多，如灌胃己烯雌酚片［6］、滅吐靈腹腔注射模型［7］、異體垂體前葉植入模型［8］、氟哌啶醇皮下注射模型［9］、滅吐靈皮下注射模型［10］等。滅吐靈能阻斷下丘腦多巴胺受體，抑制催乳素抑制因子，促進泌乳素的分泌。己烯雌酚作為雌性激素類避孕藥，也是一種多巴胺受體拮抗劑類藥物。本實驗對造模方法進行了重復和摸索，發(fā)現(xiàn)滅吐靈腹腔注射的方法重復率不高，個體差異大;灌胃己烯雌酚片的方法所需周期長;異體垂體前葉植入模型的方法過于復雜，難度較大。最終，發(fā)現(xiàn)皮下注射滅吐靈造模，具有造模時間短、操作簡便、成功率高等優(yōu)點。所選造模動物種類也很多，主要有大鼠、小鼠、兔等，以大鼠最為常用。故采用大鼠背部皮下注射滅吐靈的方法制備高泌乳素血癥模型，實驗證實其造模時間短，成功率高。

高泌乳素血癥屬中醫(yī)的“閉經(jīng)”、 “乳泣”、 “月經(jīng)過少”、“不孕”等范疇，常見病因為肝郁氣滯或肝郁化火、肝火上升;或腎虛肝郁或肝腎不足致沖任失養(yǎng)，封藏失職;或脾虛痰阻，統(tǒng)攝無權(quán)，氣血紊亂［11］?，F(xiàn)代醫(yī)學診斷高泌乳素血癥主要根據(jù)血清激素的檢測，泌乳素＞25 ng/mL、雌二醇、孕酮、促卵泡激素和促黃體生成素的降低為其特異性指標。血清泌乳素濃度的增高會擾亂下丘腦-垂體-性腺軸的功能，使下丘腦促性腺激素釋放激素 (GnRH)合成和分泌受阻，并減弱了垂體對GnRH的敏感性，導致促卵泡激素分泌低下，進而卵巢分泌的雌二醇、孕酮不足，造成卵泡發(fā)育不良和黃體功能不足而致月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)和不孕等［12］。同時，通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，高泌乳素血癥大鼠均出現(xiàn)輕度乳腺增生，乳腺小葉部分增生，個別腺泡和導管輕度增生，存在少量分泌物等。這和臨床上報道的部分高泌乳素血癥患者伴有乳腺增生癥狀相一致，說明高泌乳素血癥和乳腺增生密切相關(guān)，泌乳素的升高可促進乳腺增生的發(fā)生。目前科學界主要認為乳腺增生的發(fā)生與雌二醇和孕酮有直接的關(guān)系［13］，而忽視了泌乳素對乳腺增生的影響。近年來越來越多的文獻報道泌乳素對乳腺增生的作用，所以今后在臨床中應該增加對泌乳素的檢測，重視泌乳素與乳腺增生的關(guān)系，有助于深入研究乳腺增生的發(fā)病機制。

中藥復方能調(diào)節(jié)機體內(nèi)分泌平衡，在治療高泌乳素血癥方面優(yōu)勢突出?；厝橐衷鲆惶柗街兄赜蒙溠恳曰厝橄?，夏枯草入肝經(jīng)能消腫散結(jié)同為君藥;佐以玄參、浙貝母清熱散結(jié)，以助夏枯草散結(jié)之功，郁金能活血行氣而開郁止痛，丹參善活血散結(jié)調(diào)經(jīng)止痛，共助麥芽疏肝消脹，四味同為臣藥。白芥子利氣散結(jié)通絡(luò)止痛，昆布消痰散結(jié)，牡蠣軟堅散結(jié)，山慈菇解毒消癰散結(jié)，俱為佐藥。全方配伍，回乳、散結(jié)、疏肝、止痛之法具備，直達肝經(jīng)，共奏回乳消脹，軟堅散結(jié)，化痰通絡(luò)，行氣活血之功效?，F(xiàn)代科學研究發(fā)現(xiàn)［10］，麥芽中含有類似溴隱亭樣物質(zhì)，具有擬多巴胺激動劑的作用，其水提物治療高泌乳素血癥效果顯著。

回乳抑增一號能顯著降低高泌乳素血癥患者過高的泌乳素，調(diào)節(jié)機體下丘腦-垂體-性腺軸的平衡，改善卵巢功能，恢復卵泡和黃體功能，恢復雌二醇、孕酮、促卵泡激素和促黃體生成素的正常水平，達到治愈由高泌乳素血癥引起的溢乳、月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)和不孕等疾病的目的。同時，其也能顯著改善高泌乳素血癥引起的乳腺增生癥狀。從實驗結(jié)果看，其療效確切，與溴隱亭有相似療效，且無毒副作用，為中醫(yī)臨床應用提供了實驗依據(jù)。不過，今后的研究還要側(cè)重于回乳抑增一號治療高泌乳素血癥的組方優(yōu)化研究，因方中藥味較多，以及使用藥量很大，如何優(yōu)化配伍使其療效達到最佳，是下一步的工作目標。

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