朱冰雅， 承 偉

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州121000)

蘆薈Aloe vera L．系百合科蘆薈屬多年生常綠肉質(zhì)草本植物，性寒味苦，具有緩瀉、抗菌、消炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用［1］。蘆薈多糖 (aloe polysaccharide)是蘆薈的主要生物活性組分，是由2，3或6位部分乙?；摩?(1-4)連接的甘露聚糖和β-(1-4)連接的直鏈葡萄-甘露聚糖等多糖構(gòu)成的混合物［2］。蘆薈多糖具有抗基因毒性和抗腫瘤發(fā)生的活性雙重作用。研究者使用蘆薈多糖用于治療貓和狗的腫瘤，動物的生存時(shí)間明顯延長，瘤體出現(xiàn)局部壞死和炎癥反應(yīng)，體積明顯縮?。?］。研究發(fā)現(xiàn)蘆薈凝膠對S180、EAC瘤株均有明顯抑制作用。與抗腫瘤藥物聯(lián)合使用時(shí)，均有不同程度的增效作用［4-5］。

目前存在的蘆薈多糖抗癌研究制劑多采用蘆薈凝膠或蘆薈多糖提取液。這些劑型性質(zhì)較不穩(wěn)定，不易存儲。藥物在體內(nèi)存留時(shí)間短，釋放較快，生物利用度低下［6-7］。為了提高蘆薈多糖的生物利用度以及延長其在體內(nèi)的滯留時(shí)間，提高其抗腫瘤效果。本研究通過將含有蘆薈多糖的蘆薈包裹在生物可降解的高分子材料中制成粒徑小于1 000 nm的新型緩釋納米給藥系統(tǒng)［8］。相比于其他蘆薈多糖普通劑型，蘆薈納米粒在水中可分散為近似膠體的溶液，物理穩(wěn)定性好，有利于存儲和加熱滅菌;由于惡性腫瘤細(xì)胞膜的通透性增加，蘆薈納米粒更容易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，延長蘆薈多糖在腫瘤部位的滯留時(shí)間，提高蘆薈多糖的胞內(nèi)靶向運(yùn)輸和生物利用度，同時(shí)通過微粒的緩釋延長藥物的持續(xù)作用時(shí)間［9-10］。作者采用殼聚糖作為載體材料，采用離子交聯(lián)法制備蘆薈殼聚糖納米粒，響應(yīng)面法優(yōu)化納米粒處方工藝，并對其體外釋放特性進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AL204電子天平 (梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);JN—80超聲波清洗機(jī) (寧波江南儀器廠);JEM—1200EX透射電子顯微鏡 (日本電子公司);Nano ZS90納米粒度和Zeta電位及分子量分析儀 (英國Malvern公司);UV751GD紫外分光光度計(jì) (日本島津公司);

1.2 試藥 殼聚糖 (相對分子量為400 kDa，寧波海鑫生物制品有限公司，批號為20070427，脫乙酰度為90%);200∶1庫拉索蘆薈凝膠干粉 (云南元江生物股份有限公司，批號080125，蘆薈多糖純度20%);冰醋酸 (沈陽市華東試劑廠，批號090513);三聚磷酸鈉(TPP，天津天河試劑廠，批號090908);無水葡萄糖 (天津大茂化學(xué)試劑廠，批號090101);其余試劑 (分析純，市售)。

2 方法與結(jié)果

2.1 蘆薈殼聚糖納米粒的制備［11］通過離子交聯(lián)法，將適量殼聚糖溶解于0.1 mol/L醋酸溶液中并充分?jǐn)嚢瑁尤脒m量的蘆薈凝膠干粉使之充分溶解。采用0.01 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)殼聚糖溶液pH至適當(dāng)。在一定轉(zhuǎn)速攪拌下緩緩滴加離子聚合劑三聚磷酸鈉溶液，直至體系出現(xiàn)明顯的乳光，即得蘆薈殼聚糖納米粒，繼續(xù)攪拌一定時(shí)間，即得。最后經(jīng)過冷凍干燥得到納米粒。

2.2 檢測波長的選擇及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.2.1 檢測波長的確立 蘆薈多糖可與濃硫酸發(fā)生作用，水解成單糖，并與苯酚進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)生成有色物質(zhì)，在一定紫外波長下具有特定吸收峰［12］。實(shí)驗(yàn)以無水葡萄糖作為對照物質(zhì)，采用苯酚-硫酸法測定蘆薈中蘆薈多糖的含有量。分別將葡糖糖水溶液和輔料水溶液稀釋至一定質(zhì)量濃度后，滴加5%苯酚試液，振搖1 min，迅速加入濃硫酸，靜置20 min，在400～600 nm波長內(nèi)進(jìn)行掃描。掃描結(jié)果如圖1所示，葡萄糖在490 nm處有最大吸收，而除蘆薈外的其他輔料在此波長下則不吸收。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立 精密稱取無水葡萄糖對照品適量，采用蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的貯備溶液。準(zhǔn)確量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.5、5.0 mL貯備溶液分別置于50 mL量瓶中，加水至定容，搖勻。滴加5%苯酚試液，振搖1 min，迅速加入濃硫酸，靜置20 min，以490 nm吸光度 (A)對葡糖糖的質(zhì)量濃度 (C)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.01～0.1 mg/mL內(nèi)，A與C有良好線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為 A=5.925 2C+0.196 7，R=0.999 2(n=6)。

圖1 紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum

2.3 納米粒包封率測定 精密稱取適量蘆薈殼聚糖納米粒分散于10 mL 0.01 mol/L HCl溶液中，從而使殼聚糖在酸性介質(zhì)中充分溶解。4℃超聲15 min后在16 000 r/min下離心30 min。收集上清液，過濾，置于50 mL量瓶中，加水至定容，搖勻。滴加5%苯酚試液，振搖1 min，迅速加入濃硫酸，靜置20 min，在490 nm處測定吸收度，根據(jù)回歸方程計(jì)算納米粒中的多糖量 (以葡萄糖計(jì))。藥物總投量以多糖量計(jì)算，取最初投料量的蘆薈凝膠干粉，采用蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，滴?%苯酚試液，振搖1 min，迅速加入濃硫酸，靜置20 min，以490 nm處測定吸光度 (A)根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖的量 (以葡萄糖計(jì))。納米粒包封率按下述方程計(jì)算包封率 =(納米粒中藥物量/藥物的總投量) ×100%。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化納米粒處方工藝

2.4.1 模型建立與方差分析 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以藥物量與殼聚糖量比例 (A)、pH(B)、攪拌速度 (C)3因素作為考察對象，以藥物包封率為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考察。以 Design-Expert軟件，依據(jù)Box-Benhnken(BBD)的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理因素及水平安排實(shí)驗(yàn)，見表1。

模型進(jìn)行回歸方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表2?；貧w模型的F值為96.11，概率P＜0.000 1，表明模型極顯著;模型的確定系數(shù) Radj2值為0.981 7，表明響應(yīng)值的變化有98.17%來源于所選藥物量與殼聚糖量比例 (A)、pH(B)、攪拌速度(C)3個(gè)自變量，方程的因變量與全體自變量間具有顯著的線性關(guān)系。從表2回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知，A、B、C、A2、C2項(xiàng)差異極顯著 (P＜0.000 1)，A B、A C、B C項(xiàng)具有差異顯著 (P＜0.05)，其它項(xiàng)不顯著。方程的失擬項(xiàng) F值為3.15，P=0.148 4，概率P＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明回歸方程在整個(gè)回歸區(qū)域的擬合情況良好，可用該回歸模型代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。利用Design-Expert實(shí)驗(yàn)軟件對表1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多元回歸模型為Y=+49.355+817.95A－13.02B+0.074 975C－40.5AB+0.6AC+0.027 25BC －3 084A2+0.815B2－0.000 411C2

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.1 Design and results of RSM

表2 響應(yīng)面法方差分析Tab.2 Analysis of variance in RSM

2.4.2 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 由回歸模型處理得到藥物量與殼聚糖量比例、pH值、攪拌速度的交互作用對納米粒包封率影響的三維曲面圖 (圖2)。

圖2 納米粒包封率的影響Fig.2 Effects of the ratio on encapsulation efficiency

從響應(yīng)面分析圖上形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用?；貧w模型預(yù)測的最佳處方工藝為藥物量與殼聚糖量比例為0.14(g/g)，pH為3.0、攪拌速度294 r/min，模型預(yù)測包封率為89.94%。以此最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表3。從表3可知，模型預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)觀察值都比較接近，模型具有良好的預(yù)測性。

表3 響應(yīng)面法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Verification test of RSM

2.5 納米粒外觀形態(tài)及粒徑 在覆有支持膜的銅網(wǎng)上滴加1～2滴蘆薈殼聚糖納米粒，自然干燥3～5 min，利用JEM—1200EX透射電子顯微鏡觀察載藥納米粒的形態(tài)，見圖3。從圖3可以看出，蘆薈殼聚糖納米粒大小較均一，結(jié)構(gòu)完整，為球形或類球形。

圖3 蘆薈殼聚糖納米粒透射電境圖Fig.3 Transm ission electron m icrogram s photograph of aloe-loaded chitosan nanoparticles

2.6 釋放率測定 分別精密稱量適量采用優(yōu)化處方制備的冷凍干燥蘆薈殼聚糖納米粒和蘆薈凝膠干粉，置于透析袋中，緊密封口，放入錐形瓶中。向錐形瓶中加入200 mL磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4)，采用恒溫振蕩水浴法，溫度為 (37±0.5)℃，以100 r/min的振蕩頻率進(jìn)行體外釋放。分別于0.5、1、2、4、6、9、12、18、24 h取液10 mL，過濾，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算多糖量，并每次補(bǔ)充10 mL新鮮磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4)，計(jì)算出各時(shí)間點(diǎn)的藥物質(zhì)量濃度和累計(jì)釋放率，并繪制累計(jì)釋放率－時(shí)間曲線，結(jié)果見圖4。

圖4 蘆薈殼聚糖納米粒的體外釋放曲線(n=3)Fig.4 Drug release curves of aloe-chitosan nanoparticles(n=3)

由圖4看出，蘆薈多糖在蘆薈凝膠干粉原料藥內(nèi)6 h內(nèi)基本釋放完全達(dá)96.7%，納米粒中的蘆薈多糖在1 h內(nèi)僅釋放17.6%，18 h釋放完全達(dá)93.4%，緩釋效果明顯。以累積釋放率Q對時(shí)間t分別按不同模型進(jìn)行擬合，根據(jù)擬合優(yōu)度 (R2)來判定曲線擬合情況，結(jié)果見表4。由表4可知納米粒釋藥情況采用Ritger-Peppas模型擬合時(shí)，R2最好，擴(kuò)散指數(shù)n值為0.585 5，0.45＜n＜0.89，說明納米粒的釋放機(jī)制是擴(kuò)散和骨架溶蝕協(xié)同作用的結(jié)果［13］。

表4 蘆薈殼聚糖納米粒釋藥模型的擬合結(jié)果Tab.4 Fitting results of drug-release model of aloe-loaded chitosan nanoparticles

3 討論

殼聚糖 (chitosan)作為一種陽離子聚合物，由N-乙酰基葡糖胺和葡糖胺組成。殼聚糖上的氨基在酸性條件下發(fā)生質(zhì)子化，帶正電荷。蘆薈高度溶解在殼聚糖的酸性介質(zhì)中，當(dāng)在溶液中加入三聚磷酸鈉 (TPP)時(shí)，在三聚磷酸根負(fù)離子的引力作用下，殼聚糖聚集在一起形成顆粒。隨著殼聚糖聚集，蘆薈以物理結(jié)合的方式包裹或吸附在納米粒中。蘆薈與納米粒并未發(fā)生化學(xué)結(jié)合。通過本法形成的納米粒表面帶有正電荷，與負(fù)電荷的細(xì)胞可發(fā)生較強(qiáng)的靜電作用，延長藥物在組織器官的滯留時(shí)間，提高藥物對細(xì)胞的攝取率。本試驗(yàn)制備納米粒方法條件溫和，操作簡單，避免了有機(jī)溶劑的使用，從而可以提供一種安全有應(yīng)用潛力的藥物載體［14-15］。

響應(yīng)面法利用多項(xiàng)式近似把因子與試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系函數(shù)化，既較好地保證實(shí)驗(yàn)精度，同時(shí)可以研究多種因素交互影響。從而得到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值［16-17］。響應(yīng)面法可以連續(xù)的對實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析，具有更好的預(yù)測性。實(shí)驗(yàn)證明，采用響應(yīng)面法進(jìn)行處方優(yōu)化，得到的理論值與預(yù)測值非常接近，說明所建立的數(shù)學(xué)模型的預(yù)測性較好。

納米粒體外釋放實(shí)驗(yàn)說明，一部分藥物在納米粒制備及干燥過程中可能吸附在納米粒表面，當(dāng)與釋放介質(zhì)接觸時(shí)，能夠迅速進(jìn)入介質(zhì)中，導(dǎo)致藥物的突釋。隨著時(shí)間的推移，殼聚糖不斷被降解和溶蝕，藥物通過擴(kuò)散從納米粒內(nèi)部逐漸釋放，從而維持藥物的緩慢長期釋放。

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