張文軍，黃志文，李喜芳，張成成，劉映樂

(1.廣東藥學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，廣東廣州510006;2.武漢大學(xué)病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430072)

核糖核酸酶P(RNase P)是廣泛存在于各類生物細(xì)胞中的一種天然核酶，主要參與tRNA前體(ptRNA)5'末端的切割［1］。大腸埃希菌 RNase P最早被發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)也相對(duì)最為簡(jiǎn)單，僅由一個(gè)含377 nt的RNA亞基(M1 RNA)和一個(gè)約14 kd的蛋白亞基組成。其中，M1 RNA亞基最為保守，是催化RNA切割的活性所在［2］。研究表明，RNase P(或 M1 RNA)識(shí)別底物特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，只要底物具備5'單鏈區(qū)、雙螺旋區(qū)和3'CCA結(jié)構(gòu)即可被其識(shí)別并切割［3］。因此，對(duì)于任何已知序列的靶RNA，均可設(shè)計(jì)一小段引導(dǎo)序列(guide sequence，GS)與其互補(bǔ)結(jié)合，并形成RNase P識(shí)別的底物結(jié)構(gòu)，從而被特異性切割，由此發(fā)展出一類基于RNase P的新型反義技術(shù)。該技術(shù)在抗感染及抗腫瘤等研究領(lǐng)域有著較為廣泛的報(bào)道［4－7］。

丙型肝炎病毒(HCV)是一種單鏈正RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約9.6 kb［8］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)HCV感染者超過1.7億，大部分急性HCV感染將發(fā)展成為慢性，并最終導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭乃至肝癌［9］。由于缺乏有效的HCV疫苗，臨床上干擾素聯(lián)合病毒唑的治療方案應(yīng)答率不高且易反復(fù)。因此，發(fā)展新型抗HCV治療策略顯得較為迫切。本研究針對(duì) HCV基因組保守的調(diào)控區(qū)域——5'UTR，設(shè)計(jì)GS序列，并進(jìn)一步將其共價(jià)連接于M1 RNA的3'末端，成功構(gòu)建了一種靶向性核酶(M1GS-HCV/C67)，結(jié)果證實(shí)該人工核酶具有顯著的胞外靶向切割活性及胞內(nèi)抗病毒作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒及核苷酸片段:pGEM-3Z、pFL117質(zhì)粒(暨南大學(xué)周天鴻教授惠贈(zèng));pUC19質(zhì)粒和大腸桿菌JM109菌株(北京鼎國生物技術(shù)有限公司);pGEM-HCV/core重組質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建);引物(英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成)。

1.1.2 酶及試劑:限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、綠豆芽核酸酶、T4 DNA連接酶、T7 RNA聚合酶和DNaseⅠ(天寶生物工程有限公司);質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒(Biomiga公司);脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)和HCV核酸定量檢測(cè)試劑盒(上?？迫A生物工程有限公司)。

1.1.3 細(xì)胞及病毒:Huh7.5.1細(xì)胞系和HCV JFH-1病毒株(武漢大學(xué)吳建國教授惠贈(zèng))。

1.2 方法

1.2.1 M1GS-HCV/C67重組質(zhì)粒構(gòu)建:1)GS的設(shè)計(jì):候選靶位一般應(yīng)具備以下序列特征［10］:①切割位點(diǎn)的3'和5'分別是一個(gè)鳥嘌呤(G)和一個(gè)嘧啶(U/C);②切割位點(diǎn)下游第8位是尿嘧啶(U);③靶位處二級(jí)結(jié)構(gòu)應(yīng)相對(duì)簡(jiǎn)單，以利于GS與之結(jié)合。通過 DNAMAN與 RNA Structure4.5軟件對(duì)HCV RNA 5'UTR的序列與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)第67位胞嘧啶(C)與第68位鳥嘌呤(G)之間為潛在的切割位點(diǎn)(C67)?；贑67靶位兩側(cè)的序列，GS序列設(shè)計(jì)為:5'-AGACGCTTTCTGCCCA-3'(表1)。2)M1GS核酶基因的制備與克隆:以含 M1 RNA基因的pFL117質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增直接可獲得含M1GS核酶的基因片段。引物P1和P2限定的PCR產(chǎn)物，為包含一段長(zhǎng)88 nt橋序列的M1GS核酶基因(M1GS-HCV/C67);引物P1和 P3限定的PCR產(chǎn)物，則為不包含橋序列的M1GS核酶基因(M1GS-HCV/C67*)。在此基礎(chǔ)上，分別將上述兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pUC19載體多克隆位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ之間，從而構(gòu)建M1GS核酶基因的重組質(zhì)粒。

1.2.2 M1GS核酶及靶RNA片段制備:M1GS核酶基因克隆質(zhì)粒首先以限制酶HindⅢ線性化，再以綠豆芽核酸酶平滑末端，然后在T7 RNA聚合酶的催化下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，即可制備M1GS核酶RNA。具體方案參照使用說明書。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物依次以DNA酶I消化30 min、苯酚氯仿抽提1次、乙醇沉淀2次，保存于80%乙醇中備用。pGEM-HCV/core質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建的重組質(zhì)粒，含HCV基因組5'端的基因片段(nt 1～584)。以該質(zhì)粒作模板，通過32P-UTP摻入的體外轉(zhuǎn)錄，制備放射性核素標(biāo)記的靶RNA片段，具體見文獻(xiàn)［11］。

1.2.3 胞外切割實(shí)驗(yàn):32P標(biāo)記的靶RNA，80℃熱變性3 min、冰浴1 min，加入等摩爾的M1GS核酶RNA;37℃溫育30 min后，加入等體積含9 moL/L尿素、0.05%溴酚藍(lán)及0.05%二甲苯藍(lán)的終止液終止反應(yīng)，以8%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 (含7 mol/L尿素)進(jìn)行分離，最后以X線片放射自顯影。

1.2.4 胞內(nèi)抗病毒作用測(cè)定:Huh7.5.1細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)，待細(xì)胞豐度長(zhǎng)至約80% ～90%時(shí)，以JFH1病毒株感染，MOI為1.0。感染后2 h，以無血清培養(yǎng)基洗滌2次，再以Lipofectamine 2000將M1GS核酶轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。設(shè)立M1GS-HCV/C67實(shí)驗(yàn)組、M1GS核酶對(duì)照組(M1GSHCMV/UL97及M1GS-HCV/C67*)和空白組。轉(zhuǎn)染的方法按照試劑操作說明書。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，以Western blot檢測(cè)HCV核心蛋白的表達(dá)。此外，分別收獲感染后4、24、48、72和96 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清，以丙肝病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HCV RNA的拷貝數(shù)，評(píng)價(jià)M1GS核酶對(duì)病毒增殖的影響。

2 結(jié)果

2.1 M1GS-HCV/C67核酶基因(圖1)

2.2 M1GS-HCV/C67核酶基因克隆鑒定

如圖2所示，對(duì)克隆的M1GS核酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可見一條明顯的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。此外，以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ對(duì)克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，可見M1GS-HCV/C67和M1GSHCV/C67

*質(zhì)粒均可被切割產(chǎn)生大、小兩個(gè)片段，大片段應(yīng)為pUC19載體，小片段應(yīng)為M1GS-HCV/C67和M1GS-HCV/C67*核酶基因片段，與預(yù)期大小相符。

2.3 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物鑒定

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以8%聚丙烯酰胺電泳(含7 mol/L尿素)分離后進(jìn)行銀染(圖3)。可以看出，無論是M1GS核酶或者是HCV靶RNA片段，均只有一條明顯的條帶。這表明該反應(yīng)體系中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純度高。此外，無橋序列的核酶 M1GS HCV/C67*長(zhǎng)410 nt;M1GS HCV/C67核酶長(zhǎng)498 nt，HCV 靶 RNA片段長(zhǎng)約590 nt。從圖中泳動(dòng)位置看，各條帶分別與其預(yù)期大小相當(dāng)。因此，轉(zhuǎn)錄的特異性也較好。

表1 M1GS核酶基因的引物及其序列Table 1 Sequence of the PCR primers for the gene of M1GS ribozyme

圖1 M1GS核酶基因的結(jié)構(gòu)圖Fig 1 Schematic structure of the genes that coding for M1GS ribozymes

2.4 M1GS核酶體外切割活性檢測(cè)

與對(duì)照組相比，核酶M1GS-HCV/C67可以對(duì)底物RNA切割，產(chǎn)生兩條明顯的新條帶。5'切割產(chǎn)物大小約80 nt，3'切割產(chǎn)物大小約510 nt。從切割產(chǎn)物條帶的位置，符合預(yù)計(jì)大小，表明該切割發(fā)生于C67靶位。而在對(duì)照組，非HCV靶向性核酶(M1GS-HCMV/UL97)以及缺乏橋序列的M1GS核酶(M1GS-HCV/C67*)均不能對(duì)底物RNA產(chǎn)生切割(圖4)。

2.5 M1GS核酶胞內(nèi)抗病毒作用測(cè)定

與空白組相比，轉(zhuǎn)染M1GS-HCV/C67核酶的細(xì)胞，HCV核心蛋白表達(dá)量明顯減少(P＜0.05);而轉(zhuǎn)染M1GS-HCV/C67*核酶以及轉(zhuǎn)染M1GS-HCMV/UL97核酶，核心蛋白的表達(dá)量均無明顯減少(圖5)。進(jìn)一步測(cè)定M1GS核酶對(duì)HCV病毒增殖的影響。通過熒光定量PCR 測(cè)定不同時(shí)間(4、24、48、72和96 h)培養(yǎng)液中HCV RNA的拷貝數(shù)，變化曲線如圖6所示，M1GS-HCV/C67核酶可極顯著地抑制HCV病毒的增殖(P＜0.01)。在感染1 d后，可使HCV RNA的拷貝數(shù)降低約800倍，而M1GS HCV/C67*核酶則不能顯著抑制HCV病毒的增殖。

3 討論

圖6 HCV的增殖曲線Fig 6 The growth curve of HCV

有研究證實(shí)，RNase P識(shí)別的是底物特定的高級(jí)結(jié)構(gòu)而非一級(jí)結(jié)構(gòu)序列，底物RNA中的少量突變只要不影響特定的結(jié)構(gòu)基序，仍可被RNase P識(shí)別并特異性切割［12］。因此，這種基于RNase P的反義技術(shù)對(duì)于抑制易變異基因的表達(dá)方面，具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。目前，基于RNase P的反義技術(shù)主要有外源引導(dǎo)序列(external guide sequence，EGS)和M1GS核酶這兩大類型［13］。眾所周知，HCV變異迅速，屬于準(zhǔn)種病毒［14］。本研究采用M1GS技術(shù)對(duì)HCV進(jìn)行研究，將HCV的抗病毒治療開辟一條極具潛力的新途徑。M1GS-HCV/C67是針對(duì)HCV保守區(qū)5'UTR的一種人工靶向性核酶，其結(jié)構(gòu)與作用原理如圖7所示。

相比于EGS技術(shù)，M1GS核酶3'端的 GS可通過與相應(yīng)靶RNA結(jié)合，并可直接引導(dǎo)與其相連的M1 RNA對(duì)底物進(jìn)行切割，理論上其切割效率更高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，M1GS-HCV/C67核酶不僅可在胞外對(duì)HCV 5'UTR產(chǎn)生明顯的切割作用，而且能夠使HCV感染的Huh7.5.1細(xì)胞核心蛋白的表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)。與此同時(shí)，也將使培養(yǎng)液中HCVRNA的拷貝數(shù)顯著減少(P＜0.01)。上述結(jié)果顯示M1GS-HCV/C67核酶在胞內(nèi)有效抑制HCV的增殖，是抗HCV研究中一種極具潛力的反義分子。

圖7 M1GS核酶與底物的相互作用Fig 7 Interaction between the M1GS ribozyme and its substrate RNA

在構(gòu)建M1GS-HCV/C67核酶的同時(shí)，也構(gòu)建了另一個(gè)缺乏連接橋序列的M1GS核酶(M1GS-HCV/C67*)。該核酶針對(duì)的靶位與M1GS-HCV/C67完全相同，但卻沒有切割活性，也不能再宿主細(xì)胞內(nèi)抑制HCV的基因表達(dá)及病毒的增殖。這不僅進(jìn)一步證實(shí)橋序列對(duì)于M1GS核酶的活性至關(guān)重要，同時(shí)也為M1GS核酶抗病毒作用的研究提供了一種較為理想的內(nèi)參對(duì)照。

總之，本研究構(gòu)建的M1GS-HCV/C67核酶為新型抗HCV藥物及反義基因治療的研究提供了依據(jù)。然而，它在動(dòng)物模型中是否具有抗病毒效應(yīng)，尚有待進(jìn)一步的證實(shí)。此外，還有必要對(duì)該M1GS核酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾(如硫代化、烷基化及膽固醇化等)，以提高其穩(wěn)定性及細(xì)胞透過性，并對(duì)M1GS核酶在胞內(nèi)或體內(nèi)的毒性及代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行深入探討。

［1］Guerrier-Takada C，Gardiner K，Marsh T，et al．The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme［J］．Cell，1983，35:849 －857．

［2］Donald E，Steven MM，Norman RP，et al．RNase P:interface of the RNA and protein worlds［J］．Trends Biochemi Sci，2006，31:333 －341．

［3］ Kirsebom LA，Trobro．RNase P RNA-mediated cleavage［J］．SIUBMB Life，2009，61:189－200．

［4］Levesque MV，Levesque D，Briere FP，et al．Investigating a New Generation of Ribozymes in Order to Target HCV［J］．PLoS ONE，2010，5:e9627．doi:10．1371/journal．pone．0009627．

［5］Ko JH，Izadjoo M，Altman S．Inhibition of expression of virulence genes of Yersinia pestis in Escherichia coli by external guide sequences and RNase P ［J］．RNA，2008，14:1656－1662．

［6］Jiang X，Chen YC，Gong H，et al．Ribonuclease P-mediated inhibition of human cytomegalovirus gene expression and replication induced by engineered external guide sequences［J］．RNA Biol，2012，9:1186 －1195．

［7］Zhang WJ，Li HJ，Zhou TH et al．Effective inhibition of HCMV UL49 gene expression and viral replication by external guide sequences and RNase P ［J］．Virology J，2010，7:100－108

［8］Hengli T，Henry G．Cellular and molecular biology of HCV infection and hepatitis［J］．Clini Sci，2009，117:49 －65．

［9］Stefan Z，Pietro A，Stanislas P，et al．Telaprevir for Retreatment of HCV Infection ［J］．N Engl J Med，2011，364:2417－2428．

［10］Lundblad EW，Altman S．Inhibition of gene expression by RNase P［J］．New Biotechnol，2010，27:212 －219．

［11］張文軍，劉碧瑜，周玉珍等．一種HCV靶向性M1GS核酶的構(gòu)建及其抗病毒活性［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:84－88．

［12］Kirsebom LA．RNase P RNA mediated cleavage:Substrate recognition and catalysis ［J］．Biochimie，2007，89:1183－1194．

［13］Liu FY，Altman S．RNase P［M］．Zouhair Atassi．Protein Reviews．Houston，Texas:Springer Science+Business Media，2010:266－271．

［14］Farci P．New insights into the HCV quasispecies and compartmentalization［J］．Semin Liver Dis，2011，31:356－374．