熊麗霞， 李文林， 蔡震宇， 周 瑩， 熊俊平， 趙 林， 何曉燕， 石小玉△

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，2江西省醫(yī)學(xué)生物高技術(shù)重點實驗室，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室，4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，江西 南昌330006)

纖維化發(fā)生可能是由于I 型與II 型細(xì)胞因子之間失平衡而引起的，并以II 型細(xì)胞因子反應(yīng)為主。I型細(xì)胞因子可促進(jìn)正常組織結(jié)構(gòu)的修復(fù)，II 型細(xì)胞因子可使成纖維細(xì)胞增生活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積和纖維化［1-2］。I 型細(xì)胞因子包括干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)、IL-12 及IL-18 等，II 型細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10、IL-13 和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)等。體內(nèi)、外研究資料表明，當(dāng)細(xì)胞因子的平衡以II 型細(xì)胞因子占優(yōu)勢時，就會發(fā)生纖維化［3］。IL-4、IL-13 等II 型細(xì)胞因子是通過刺激和激活轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來促進(jìn)纖維生成［4］。

IFN-γ 是NK 細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的具有高度生物活性的一種細(xì)胞因子。近年來，越來越多的研究顯示IFN-γ 對纖維化的形成具有強烈的抑制作用［5］，具有抑制培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞增生及膠原聚集等作用，與II 型細(xì)胞因子IL-4 及TGF-β 具有拮抗作用［6］，因此被認(rèn)為是很有前途的抗纖維化藥物之一［7］。IFN-γ 對IL-13 的促膠原合成作用是否具有拮抗作用?是否對瘢痕纖維化具有治療作用?其效果如何?以上問題仍不清楚。我們前期實驗結(jié)果顯示IL-13 能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、I 型前膠原mRNA 的轉(zhuǎn)錄和I 型膠原蛋白的合成，并證實了IL-13 的這些作用是通過將JAK/STAT6 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的轉(zhuǎn)錄因子STAT6 磷酸化來實現(xiàn)的［8-9］。本實驗擬探明在體外培養(yǎng)條件下IFN-γ 對致纖維化因子IL-13對成纖維細(xì)胞促膠原合成作用的拮抗作用及其對纖維化的治療效果，為進(jìn)一步探討纖維化的機制提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞株 成纖維細(xì)胞3T3 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑 細(xì)胞因子IL-13 購于PeproTech;DMEM 培養(yǎng)基購于Gibco-BRL，按說明書配制，4 ℃保存;特級胎牛血清購于杭州四季青生物制品公司，使用前56 ℃水浴30 min 滅活補體后分裝，－20 ℃保存。MTT 購于Sigma;DMSO 購于上海華美生物工程公司。重組人IFN-γ 購于上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司。羥脯氨酸試驗檢測盒購于南京建成生物工程研究所。RT-PCR 試劑購于TaKaRa。Western blotting 試劑:羊抗I 型膠原蛋白抗體、羊抗actin 抗體購于Santa Cruz;兔抗羊IgG-HRP 購于北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 RT-PCR 引物的設(shè)計和合成 引物利用Primer Premier 5.0 軟件，參照GenBank 中I 型膠原α1 基因(collagen type I alpha 1，Col1A1)(登錄號為NM－007742)的序列設(shè)計，由TaKaRa 公司(大連寶生物)合成。Col1A1 引物序列(產(chǎn)物378 bp):上游引物5’-ACAGAGGCATAAAGGGTCA-3’，下游引物5’-CAAGGTCACGGTCACGAA-3’;β-actin 引物序列(產(chǎn)物511 bp):上游引物5’-AgCGGGAAATCGTGCGTGAC -3 ’， 下 游 引 物 5 ’-AAGCATTTGCGGTGGACGAT -3’。

2 方法

2.1 成纖維細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)及分組 成纖維細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含15%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期成纖維細(xì)胞，調(diào)整其細(xì)胞密度為(5 ×108)～(1 ×109)/L。在羥脯氨酸釋放實驗、RT-PCR 和Western blotting 實驗中均分為實驗組和空白對照組。實驗前，每組細(xì)胞均用無血清DMEM 培養(yǎng)12 ～16 h，實驗組:IL-13(100 μg/L)(濃度參考見文獻(xiàn)［9］)+IFN-γ(4 ×105U/L)作用成纖維細(xì)胞24、48 和72 h，再進(jìn)行以上各實驗。然后進(jìn)行對比實驗，分成4 組:空白對照組、IFN-γ 組、IL-13 組和IFN-γ+IL-13 組，72 h 后檢測Col1A1 mRNA 表達(dá)和I 型膠原蛋白的表達(dá)水平。

2.2 MTT 實驗 將細(xì)胞以2.5 ×107/L 密度接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，分6 組，分別為:空白組(不加細(xì)胞)、對照組(不加細(xì)胞因子)、IFN-γ(2 ×105U/L)組、IFN-γ(4 ×105U/L)組、IFN-γ(6 ×105U/L)組和IFN-γ(8 ×105U/L)組，每組3 孔，共接種18 孔，5%CO2、37 ℃溫箱中培養(yǎng)20 h，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)液洗1 次，加150 μL 二甲基亞砜溶解沉淀，振蕩10 min，結(jié)晶物溶解。比色:選擇570 nm 波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上，以空白孔調(diào)零，測定各孔吸光度(A)。以空白未加藥物組作為對照組，其余各組抑制率(%)=(1－A實驗組/A對照組)×100%。

2.3 羥脯氨酸釋放實驗( 總膠原含量測定) 細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行羥脯氨酸釋放實驗，比較各實驗組和空白對照組羥脯氨酸含量的差別，按試劑盒說明操作。

2.4 RT-PCR 法 各組細(xì)胞均用SV total RNA isolation system 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成第1 條cDNA，使用Col1A1 和β-actin 特異性引物，按照TKR RTPCR kit 標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)參照β-actin 與Col1A1 在同一管內(nèi)擴(kuò)增，進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳。

2.5 Western blotting 實驗 各組細(xì)胞用RIPA buffer將細(xì)胞充分裂解，Bio-Rad Dye Reagent 進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整樣品中蛋白質(zhì)含量，均以20 μg 蛋白量上樣進(jìn)行7%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸纖維膜轉(zhuǎn)印。50 g/L 脫脂奶粉4 ℃封閉，TBS 洗滌，經(jīng)I 型膠原蛋白第I 抗體和第II 抗體分別孵育后，ECL 試劑顯像。再利用清除緩沖液清除硝纖膜上已結(jié)合的I抗和II 抗，重新經(jīng)β-actin I 抗、II 抗孵育后，再次顯像，作為內(nèi)參照。對結(jié)果利用凝膠定量軟件Quantity One(Bio-Rad)進(jìn)行吸光度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，以單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 IFN-γ 對成纖維細(xì)胞增殖的影響

用不同濃度IFN-γ 作用成纖維細(xì)胞，MTT 法檢測IFN-γ 對成纖維細(xì)胞增殖的作用，當(dāng)IFN-γ 濃度在2 ×105U/L ～8 ×105U/L 時，細(xì)胞抑制率明顯上升。為此，我們?nèi)? ×105U/L 作為IFN-γ 對成纖維細(xì)胞作用的濃度，見圖1。

Figure 1. The anti-proliferation effect of IFN-γ on fibroblasts.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 U/L.圖1 不同濃度IFN-γ 對成纖維細(xì)胞生長的影響

2 IFN-γ 抑制IL-13 對成纖維細(xì)胞分泌總膠原含量的影響

羥脯氨酸是膠原分解代謝的產(chǎn)物，機體內(nèi)的羥脯氨酸主要存在膠原中，因此，羥脯氨酸是反映膠原含量的重要指標(biāo)。前期實驗結(jié)果顯示IL-13 刺激成纖維細(xì)胞24 h 后分泌的總膠原含量增高，48 h 組顯著高于對照組(P ＜0.05)，持續(xù)至72 h(P ＜0.01)，本研究結(jié)果顯示IFN-γ +IL-13 作用成纖維細(xì)胞后，在24 h 與空白對照組相比可見分泌的總膠原含量減少，48 h 顯著減少(P ＜0.05)，72 h 減少更加明顯(P＜0.01)，見圖2。

Figure 2. Hydroxyproline release of fibroblast cells in experimental group.Mean±SD. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 h.圖2 IFN-γ+IL-13 作用后成纖維細(xì)胞羥脯氨酸的變化

3 IFN-γ 抑制IL-13 對Col1A1 mRNA 水平的影響

RT-PCR 結(jié)果顯示，在空白對照組、IFN-γ 和IL-13共同作用的實驗各組都出現(xiàn)了明顯的Col1A1 mRNA 表達(dá)，比較各實驗組Col1A1 mRNA 表達(dá)與空白對照組相比，實驗24 h 組有所減弱，實驗48 h 和72 h 組有顯著減弱(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見圖3。進(jìn)一步進(jìn)行各因素比較，分成空白對照組、IFN-γ 組、IL-13 組和IFN-γ+IL-13 組，72 h 后觀察到IFN-γ 組Col1A1 mRNA 表達(dá)顯著低于空白對照組(P ＜0.05)，IL-13 組顯著高于空白對照組(P ＜0. 05)，而IFN-γ+IL-13 組顯著低于其它組(P ＜0.01)，見圖4。這說明IFN-γ 可抑制IL-13 的促成纖維細(xì)胞Col1A1 mRNA 表達(dá)作用。

Figure 3. Effect of IFN-γ on IL-13-induced Col1A1 mRNA expression. Mean±SD. n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖3 IFN-γ 對IL-13 促成纖維細(xì)胞Col1A1 mRNA 表達(dá)的影響

Figure 4. Effects of IFN-γ and IL-13 on Col1A1 mRNA expression. Mean±SD. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs IFN-γ+IL-13.圖4 IFN-γ 和IL-13 對成纖維細(xì)胞Col1A1 mRNA 表達(dá)的影響

4 IFN-γ 抑制IL-13 的促成纖維細(xì)胞I 型膠原蛋白表達(dá)作用

Western blotting 結(jié)果顯示，空白對照組及實驗各組均出現(xiàn)了I 型膠原蛋白條帶，灰度分析表明IL-13(100 μg/L)和IFN-γ(4 ×105U/L)作用24 h 后，I 型膠原蛋白表達(dá)有所減弱，48 h 組顯著減弱(P ＜0.05)，72 h 組減弱最明顯(P ＜0.01)，見圖5。進(jìn)一步在蛋白水平進(jìn)行各因素比較，分成空白對照組、IFN-γ 組、IL-13 組和IFN-γ+IL-13 組，72 h 后觀察到IFN-γ 組成纖維細(xì)胞I 型膠原蛋白的表達(dá)顯著低于空白對照組(P ＜0.05)，IL-13 組顯著高于空白對照組(P ＜0.05)，而IFN-γ +IL-13 組顯著低于其它組(P ＜0.01)，見圖6。這說明IFN-γ 抑制IL-13 的促成纖維細(xì)胞I 型膠原蛋白表達(dá)作用。

討 論

Figure 5. Effect of IFN-γ on IL-13-induced expression of collagen type I. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖5 IFN-γ 對IL-13 促成纖維細(xì)胞I 型膠原蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. Effects of IL-13 and IFN-γ on the expression of collagen type I. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs IFN-γ+IL-13.圖6 IFN-γ 和IL-13 對成纖維細(xì)胞I 型膠原蛋白表達(dá)的影響

纖維化的發(fā)生可以影響到包括心、肺、肝、腎及皮膚等器官，纖維化已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)上一個重要的病因?qū)W問題［10-11］。動物實驗和臨床研究均表明，II 型細(xì)胞因子和TGF-β 在纖維化形成過程中起著非常重要的作用，而在I 型細(xì)胞因子占優(yōu)勢的小鼠組織中與修復(fù)相關(guān)的許多基因被上調(diào)，這時無纖維化顯著活化的證據(jù)，說明IL-13 和TGF-β 為致纖維化因子，而IFN-γ 具有抑制纖維化作用。Tredget 等［12-13］證實瘢痕組織和成纖維細(xì)胞的TGF-β mRNA 和蛋白水平在體內(nèi)外被IFN-γ 和IFN-α 中和;并且觀察了燒傷后1年發(fā)展成肥厚性瘢痕的病人，1 年內(nèi)連續(xù)用流式細(xì)胞術(shù)觀察T細(xì)胞和細(xì)胞因子的作用，發(fā)現(xiàn)損傷1個月內(nèi)血清中未測到IFN-γ，損傷2 個月后IL-4 和IL-13陽性Th2 細(xì)胞比對照組顯著增加，在瘢痕組織中IFN-γ mRNA 水平下降而IL-4 mRNA 水平增高，這充分說明了燒傷后肥厚性瘢痕病人極化的Th2 細(xì)胞效應(yīng)。Aliprantis 等［14］和Lakos 等［15］的研究表明IL-13是一個重要的前纖維化介質(zhì)，通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Tbet 減少組織IFN-γ 水平而促進(jìn)博萊霉素誘導(dǎo)的皮膚纖維化。不少實驗在一些纖維增生紊亂性疾病的研究中觀察到IFN-γ 能抑制成纖維細(xì)胞分泌膠原［16］。Jordana 等［17］應(yīng)用IFN-γ 治療博萊霉素誘發(fā)的大鼠纖維化，發(fā)現(xiàn)組胺和羥脯氨酸的含量明顯降低，肺纖維化的程度減輕。

本研究觀察到4 ×105U/L 濃度的IFN-γ 對體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞能達(dá)到最大抑制作用，并能抑制IL-13 的促Col1A1 轉(zhuǎn)錄和I 型膠原蛋白合成作用，說明I 型細(xì)胞因子的抗纖維化效應(yīng)可以對抗II 型細(xì)胞因子的纖維化效應(yīng)，也進(jìn)一步證實了IFN-γ 有抑制纖維化的作用。Grassegger 等［18］確定了IFN-γ 在臨床皮膚病中的顯著作用，認(rèn)為IFN-γ 是抗增殖和抗纖維化的關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)因子，可應(yīng)用于多種纖維化條件下，如硬皮病性皮膚纖維化、自發(fā)性肺纖維化、放射后皮膚纖維化等。分析其機制可能是:(1)抑制成纖維細(xì)胞有絲分裂;(2)降低I 和III 型前膠原α 鏈的mRNA 穩(wěn)態(tài)水平;(3)刺激膠原酶的產(chǎn)生，并能抑制膠原合成所必需的脯氨酸羥化酶的產(chǎn)生，因此，IFN-γ 具有抑制創(chuàng)傷修復(fù)的作用，是創(chuàng)傷與瘢痕修復(fù)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。

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