趙 立， 茍 萍， 王 霞， 郭星軍

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046)

心血管疾病是當(dāng)今世界威脅人類健康的嚴(yán)重疾病之一，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢。心腦血管疾病是一種復(fù)雜的、多因素導(dǎo)致的疾病，血脂(膽固醇和甘油三酯)升高是導(dǎo)致心血管疾病的重要原因。血清總膽固醇 (TC)水平及低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)與心血管病發(fā)病率之間呈正相關(guān)，而高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)升高可降低心血管病的發(fā)病率。目前還沒有副作用小的特效降血脂藥物。近年利用食物和食物中的某種成分達(dá)到降血脂的目的日益受到人們的重視，大蒜及大蒜制品在醫(yī)藥和保健方面的作用已得到普遍的認(rèn)可。大蒜Alltim sativum L．是多年生草本植物，是百合科蔥屬植物蒜的鱗莖。大蒜中具有藥理作用的成分是一類含硫的有機(jī)化合物，主要有S-烯丙基半胱氨酸和蒜氨酸，在蒜氨酸酶的催化下蒜氨酸縮合形成大蒜素 (Allicin，主要成分是二烷基硫代亞磺酸酯和烷基-2-丙烯基硫代亞磺酸酯)。在細(xì)胞內(nèi)，大蒜素可先分解為二硫和三硫化合物，最終產(chǎn)生烯丙基硫醇和烯丙甲基硫化物，這些化合物有較強(qiáng)的反應(yīng)能力，能夠修飾含巰基的酶類，是大蒜起治療作用的關(guān)鍵物質(zhì)［1-3］。新鮮大蒜鱗莖中蒜氨酸和蒜氨酸酶在細(xì)胞的不同部位獨(dú)立穩(wěn)定存在，當(dāng)大蒜破碎后，蒜氨酸和蒜氨酸酶相互接觸，蒜氨酸酶催化蒜氨酸生成有揮發(fā)性的大蒜素。體外及動物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)大蒜素通過調(diào)節(jié)血脂代謝降低血脂，大蒜素在臨床上防治心腦血管疾病應(yīng)用日趨廣泛，但是大蒜素理化性質(zhì)不穩(wěn)定，在常溫下可進(jìn)一步分解，生物半衰期短 (t1/2=2．32 h)，因而影響其藥理作用及療效［4］。大蒜素的前體物質(zhì)蒜氨酸和蒜氨酸酶較穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)通過分別制取蒜氨酸和蒜氨酸酶，比較大蒜素與蒜氨酸+蒜氨酸酶對高血脂小鼠血脂代謝的影響，為更好地開發(fā)利用大蒜中的降血脂活性成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料及主要儀器

1．1．1 材料 市售新鮮吉木薩爾縣大蒜。

1．1．2 試劑 總膽固醇測定試劑盒、甘油三脂檢測試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒、低密度脂蛋白-膽固醇檢測試劑盒、超氧化物歧化酶檢測試劑盒、丙二醛檢測試劑盒 (均購于南京建成生物工程研究所，批號090219)，3-羥-3-甲戊二酸卓酰輔酶 A(HMG-CoA)、二硫蘇糖醇 (DTT)、還原型輔酶Ⅱ (NADPH)為Sigma產(chǎn)品，其余藥品均為分析純。

1．1．3 主要儀器 SZ2型雙配套循環(huán)水式多用真空泵;減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;冷凍干燥機(jī);高效液相色譜儀;日立超高速離心機(jī);酶標(biāo)儀。

1．2 實(shí)驗(yàn)動物 昆明種小白鼠，體質(zhì)量 (25±2)g，雌雄兼用，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。動物基礎(chǔ)飼料購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。高脂飼料配方:78．8%基礎(chǔ)飼料中加入1%膽固醇，10%豬脂肪油，10%蛋黃粉，0．2%膽酸鹽。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 大蒜素的制備及測定 稱取鮮蒜瓣100 g，加 pH 6．4 NaH2PO4-K2HPO4緩 沖 液 100 mL(蒜瓣∶提取液=1∶1)，于組織搗碎機(jī)中破碎勻漿，勻漿液在32℃水浴中充分酶解30 min，加入95%乙醇 (料液比=1∶4)，在32℃水浴中萃取1 h，萃取液抽濾，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，濃縮至10 mL左右，冷凍干燥，即得到大蒜素。大蒜素質(zhì)量濃度的測定采用 DTNB［5，5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)］比色法［5］，大蒜素含量的計(jì)算公式為:C=ΔA412×d×162．26/(2×14150)(ΔA412=A0-A)。

式中:C為大蒜素的質(zhì)量濃度 (mg/mL);d為總稀釋倍數(shù);162．26為大蒜素相對分子質(zhì)量;14 150為DTNB與大蒜素反應(yīng)產(chǎn)物NTB(2-硝基-5-硫代苯甲酸)在412 nm、1 cm光徑的摩爾消光系數(shù);A0為大蒜素在412 nm處的吸光值;A為DTNB與大蒜素反應(yīng)產(chǎn)物NTB在412 nm處的吸光值。

大蒜素得率 (g/kg)=提取液或產(chǎn)品中大蒜素的質(zhì)量 (g)/大蒜原料的質(zhì)量 (kg)

通過公式計(jì)算濃縮液中大蒜素質(zhì)量濃度為0．3 mg/mL，其得率為 2．34 g/kg。

1．3．2 蒜氨酸的分離純化及鑒定 參照黃雪松等方法提?。?］。稱取去皮新鮮大蒜200 g，將蒜瓣在沸水中加熱煮沸10 min，使蒜氨酸酶失活，冷卻。將蒜瓣和100 mL蒸餾水置于搗碎機(jī)中打漿，用八層紗布過濾蒜汁，真空抽濾，除去大蒜組織顆粒等雜質(zhì)，得到大蒜汁。將大蒜汁液上陽離子交換樹脂柱，先用去離子水洗至中性后，再用0．7 mol/L氨水洗脫，將含有蒜氨酸的洗脫液合并，經(jīng)真空濃縮，加入乙醇，調(diào)節(jié) pH值為5．5至6．5，4℃冰箱中靜置可得到蒜氨酸結(jié)晶，HPLC檢測純度達(dá)95% 以上［7］。

1．3．3 蒜氨酸酶的提取分離與活力測定 稱取去皮鮮蒜200 g，放入組織搗碎機(jī)置4℃冰箱預(yù)冷。向組織搗碎機(jī)中加入4℃預(yù)冷的Na/K磷酸緩沖液200 mL(蒜瓣∶提取液=1∶1)，破碎勻漿，在4℃4 000 r/min離心20 min，棄去殘?jiān)?。將上清液加?0%飽和硫酸銨，4℃下靜置2 h，8 000 r/min離心20 min，棄去沉淀。再向上清液中加入50%飽和硫酸銨，4℃下靜置過夜，8 000 r/min離心20 min，沉淀即為蒜氨酸粗酶。蒜氨酸酶活力的測定采用丙酮酸法［8］，測得酶活力單位為24 720 U/mg。

1．3．4 高血脂模型建立 昆明種小白鼠90只，經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，禁食12 h，尾靜脈取血測定總膽固醇，根據(jù)測定的膽固醇水平分為9組，每組10只，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。9組分別為對照組(飼喂基礎(chǔ)飼料)，高血脂模型組 (飼喂高脂飼料)，高脂飼料+大蒜素高、中、低劑量組，高脂飼料+蒜氨酸+蒜氨酸酶高、中、低劑量組及血脂康組。腹腔注射給藥，注射量為0．1～0．2 mL/10 g體質(zhì)量。對照組和模型組每天注射等量0．9%生理鹽水，大蒜素高劑量組、中劑量組和低劑量組給藥劑量分別為10 mg/mL、5 mg/mL和2 mg/mL。蒜氨酸+蒜氨酸酶混合液 (2∶1)高劑量組、中劑量組和低劑量組給藥劑量分別為10 mg/mL、5 mg/mL和2 mg/mL，血脂康的劑量為2 mg/mL。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水和進(jìn)食，連續(xù)8周。末次給藥后，所有動物禁食12 h，眼底靜脈取血，血液在37℃下水浴30 min，3 500 r/min離心15 min，分離血清，用 試 劑 盒 測 定 TC、TG、HDL-C、LDL-C、SOD、MDA。

1．3．5 HMG-CoA還原酶測定 小鼠肝微粒體HMG-CoA還原酶制備參照文獻(xiàn) ［9-10］董朝輝、李鵬等的方法，HMG-CoA還原酶活力測定按文獻(xiàn)［11］的方法進(jìn)行。1個酶活力單位 (U)定義為1 L溶液中每分鐘消耗1μmol的HMG-CoA所需的酶量。

2 結(jié)果

2．1 高脂小鼠模型的建立

高脂飼料飼喂的小鼠體質(zhì)量發(fā)生明顯變化，與對照組比較，四周后體質(zhì)量增加達(dá)20%(見表1)。高脂飼料喂養(yǎng)2周后，TC和TG水平分別上升了33．3% 和12．5%。喂養(yǎng)4周后，TC和 TG水平分別上升了45．5%和37．5%，方差分析顯示有顯著差異 (P＜0．01)，小鼠高脂模型構(gòu)建成功。

表1 建模過程小鼠體質(zhì)量及血脂水平的變化(n=10)Tab.1 Body weight and blood lipids ofm ice changes in setup models(n=10)

2．2 大蒜生理活性物質(zhì)對高血脂小鼠血漿脂蛋白的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高、中、低劑量的大蒜素組與高血脂組相比，TC水平分別降低32．1%、29．1%和25．2%，差異顯著，P＜0．001。高、中、低劑量的蒜氨酸 +蒜氨酸酶分別降低33．4%、27．7%和25．9%，差異顯著，P＜0．001。高劑量組的大蒜素及蒜氨酸+蒜氨酸酶降低TC的有效率接近于血脂康組。高、中、低劑量的大蒜素及蒜氨酸+蒜氨酸酶能一定程度的降低高脂小鼠血清TG水平。高、中、低劑量的大蒜素及蒜氨酸+蒜氨酸酶能提高高血脂小鼠血清中HDL-C的水平，降低LDL-C水平，與高血脂組相比，差異顯著，P＜0．001(表2)。

表2 大蒜活性物質(zhì)對高血脂小鼠血脂水平的影響(n=10， ± s)Tab.2 Effect of garlic active substances on serum lipids in hyperlipidem ia m ice(n=10， ± s)

表2 大蒜活性物質(zhì)對高血脂小鼠血脂水平的影響(n=10， ± s)Tab.2 Effect of garlic active substances on serum lipids in hyperlipidem ia m ice(n=10， ± s)

注:與高血脂組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01，＊＊＊P ＜0．001。下表同。

組 別TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)HDL-C/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)空白對照組 2．253 ±0．32 0．826 ±0．056 1．809 ±0．211 1．771 ±0．109高血脂組 4．15 ±0．76 2．274 ±0．155 1．098 ±0．328 2．467 ±0．413血脂康組 2．687 ±0．277＊＊＊ 1．809 ±0．108 1．686 ±0．217＊＊＊ 1．821 ±0．124＊＊＊低劑量蒜素組 3．106 ±0．187＊＊＊ 2．227 ±0．102 1．286 ±0．167＊＊＊ 2．203 ±0．310＊＊＊中劑量蒜素組 2．941 ±0．219＊＊＊ 2．035 ±0．121 1．346 ±0．308＊＊＊ 2．164 ±0．236＊＊＊高劑量蒜素組 2．819 ±0．231＊＊＊ 1．892 ±0．097 1．432 ±0．242＊＊＊ 1．998 ±0．115＊＊＊低劑量蒜氨酸 +蒜酶組 3．074±0．112＊＊＊ 2．174±0．171 1．292±0．109＊＊＊ 2．121±0．259＊＊＊中劑量蒜氨酸 +蒜酶組 3．002±0．181＊＊＊ 2．094±0．144 1．364±0．286＊＊＊ 2．099±0．144＊＊＊高劑量蒜氨酸 +蒜酶組 2．761±0．138＊＊＊ 1．831±0．261 1．498±0．181＊＊＊ 1．911±0．208＊＊＊

2．3 大蒜活性物質(zhì)對高血脂小鼠SOD酶活力及MDA水平的影響

超氧化物歧化酶 (SOD)是體內(nèi)重要的氧自由基清除劑，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。丙二醛 (MDA)是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用而形成的脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物。SOD活力和MDA水平的高低可反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力和機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。高血脂癥可以抑制SOD的表達(dá)和分泌，導(dǎo)致血清中MDA顯著增加。高、中、低劑量的大蒜素及蒜氨酸+蒜氨酸酶呈劑量依賴性顯著提高高血脂小鼠血清中SOD酶活力，與高血脂模型組比較，P＜0．001，高劑量蒜氨酸+蒜氨酸酶提高SOD活力近于血脂康 (表3)。MDA測定結(jié)果表明，高、中、低劑量的大蒜素及蒜氨酸+蒜氨酸酶能夠降低高血脂小鼠血清中MDA，并呈現(xiàn)劑量依賴性。大蒜素及蒜氨酸+蒜氨酸酶能通過提高SOD活性，清除氧自由基，降低血清MDA水平。

表3 大蒜活性物質(zhì)對高血脂小鼠SOD與MDA的影響(n=10， ± s)Tab.3 Effect of garlic active substances on SOD and MDA in hyperlipidem ia m ice(n=10， ± s)

表3 大蒜活性物質(zhì)對高血脂小鼠SOD與MDA的影響(n=10， ± s)Tab.3 Effect of garlic active substances on SOD and MDA in hyperlipidem ia m ice(n=10， ± s)

血清SOD/(U·mL-1)血清MDA/(nmol·mL-1)空白對照組219．7 ±17．3 2．285 ±0．571高血脂組 143．4 ±19．6 4．103 ±1．025血脂康組 199．2 ±25．2＊＊＊ 3．285 ±0．887＊＊低劑量蒜素組 163．9 ±12．6＊＊＊ 3．466 ±1．007中劑量蒜素組 173．4 ±10．5＊＊＊ 2．977 ±0．738＊＊高劑量蒜素組 190．3 ±14．4＊＊＊ 2．874 ±0．962＊＊低劑量蒜氨酸 + 蒜酶組 168．4 ±15．4＊＊＊ 3．234 ±0．693＊＊＊中劑量蒜氨酸 + 蒜酶組 184．0 ±17．5＊＊＊ 2．835 ±0．832＊＊高劑量蒜氨酸+蒜酶組 193．8±21．8＊＊＊ 2．641±0．799＊＊＊

2．4 大蒜活性物質(zhì)對高血脂小鼠HMG-CoA還原酶活力的影響

HMG-CoA還原酶是膽固醇合成的限速酶，該酶活力與體內(nèi)膽固醇的合成量呈正相關(guān)。高、中、低劑量的大蒜素分別使高血脂小鼠血清中的HMGCoA 還原酶活力降低 53．5%、38．9% 和 30．3%，蒜氨酸 +蒜氨酸酶分別為 55．1%、39．6% 和33．6%，P＜0．001(表4)。大蒜素和蒜氨酸 +蒜氨酸酶能通過抑制HMG-CoA還原酶活力，降低膽固醇的合成。

表4 大蒜活性物質(zhì)對高血脂小鼠肝臟HMG-CoA還原酶活力的影響 (n=10， ± s)Tab.4 Effect of garlic active substances on HMG-CoA activities in the liver of hyperlipidem ia m ice(n=10， ± s)

表4 大蒜活性物質(zhì)對高血脂小鼠肝臟HMG-CoA還原酶活力的影響 (n=10， ± s)Tab.4 Effect of garlic active substances on HMG-CoA activities in the liver of hyperlipidem ia m ice(n=10， ± s)

HMG-CoA還原酶活力/U空白對照組1．985 ±0．478高血脂組 7．889 ±1．982血脂康組 2．946 ±0．340＊＊低劑量蒜素組 5．498 ±1．438＊＊中劑量蒜素組 4．823 ±1．228＊＊高劑量蒜素組 3．665 ±0．965＊＊低劑量蒜氨酸 + 蒜氨酸酶組 5．239 ±1．366＊＊中劑量蒜氨酸 + 蒜氨酸酶組 4．767 ±1．191＊＊高劑量蒜氨酸+蒜氨酸酶組 3．544±0．968＊＊

3 討論

膽固醇、低密度脂蛋白 (LDL)和甘油三酯水平升高與動脈粥樣硬化及心腦血管疾病的危險性增加有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)大蒜提取物能提高高密度脂蛋白，明顯降低高血脂動物總膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯的水平［12-15］。近年大蒜提取物降血脂的一些臨床實(shí)驗(yàn)中得到了不一致的結(jié)果，大蒜提取物降血脂作用不顯著，這可能是大蒜制品不同;其功效成分、生物有效性不同;或大蒜素不穩(wěn)定，造成在臨床實(shí)驗(yàn)中很難得到一致性的結(jié)果［16-17］。本實(shí)驗(yàn)利用穩(wěn)定的大蒜素前藥蒜氨酸+蒜氨酸酶，臨用前混合進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，避免了大蒜素不穩(wěn)定導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不確定性。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)蒜氨酸+蒜氨酸酶降低高血脂小鼠總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的效果與大蒜素相當(dāng)，或優(yōu)于大蒜素 (表2)。蒜氨酸+蒜氨酸酶提高高密度脂蛋白膽固醇的效果優(yōu)于大蒜素 (表2)，這些結(jié)果說明分別制備蒜氨酸和蒜氨酸酶，臨用時混合是開發(fā)利用大蒜降血脂藥物的新途徑。

超氧化物歧化酶通過清除體內(nèi)的氧自由基而避免脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生丙二醛。本實(shí)驗(yàn)中蒜氨酸+蒜氨酸酶能夠提高SOD活力，降低丙二醛水平 (表3)，說明大蒜素降血脂的機(jī)制之一可能與抗氧化途徑密切相關(guān)。高、中、低劑量的蒜氨酸+蒜氨酸酶呈劑量依賴性抑制膽固醇合成途徑中的限速酶3-羥-3-甲基-戊二酸單酰CoA還原酶 (表4)，與一些學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［12，18-19］。3-羥-3-甲基-戊二酸單酰CoA還原酶的活性受底物正調(diào)節(jié)和終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)，對控制膽固醇的合成起重要作用。因此，認(rèn)為大蒜提取物抑制膽固醇的合成是降血脂的主要機(jī)制［13，20］。Gebhardt等［12，19］研究發(fā)現(xiàn)大蒜提取物能夠抑制培養(yǎng)的鼠肝細(xì)胞和人肝細(xì)胞瘤HMGCoA還原酶活性，導(dǎo)致膽固醇合成下降;高濃度大蒜提取物及衍生物還能導(dǎo)致羊毛固醇、2-脫氫膽固醇和7-脫氫膽固醇積累，因此認(rèn)為大蒜提取物及衍生物還能抑制HMG-CoA還原酶下游的其它與膽固醇合成相關(guān)的酶。Dev等［21］實(shí)驗(yàn)表明大蒜提取物能抑制膽固醇合成途徑羊毛固醇下游的甾醇4α-甲基氧化酶，導(dǎo)致4-二甲基甾醇、羊毛固醇、二甲基酵母甾醇積累，這些物質(zhì)又反饋抑制HMGCoA還原酶。蒜氨酸和蒜氨酸酶混合使用有明顯的降低血脂作用，其機(jī)制可能是通過抑制肝臟膽固醇合成途徑中的酶抑制了膽固醇的合成，促進(jìn)血清和肝臟甘油三酯的分解;促進(jìn)脂蛋白之間的代謝與轉(zhuǎn)化，降低低密度脂蛋白，增加高密度脂蛋白;阻斷脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)。利用蒜氨酸和蒜氨酸酶的降血脂作用治療高脂血癥、預(yù)防動脈粥樣硬化、冠心病等具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

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