柏夢(mèng)炎，蘇鴻雁，劉碩然

(大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理 671003)

1.前言

歐洲油菜 (Brassica napus L.)屬十字花科蕓薹屬，又名油麻菜籽，麻油菜籽等。歐洲油菜目前主要被當(dāng)作油料作物，有的時(shí)候也被當(dāng)作動(dòng)物飼料來(lái)使用。近些年，在油料作物種植中，歐洲油菜已躍居第二 (僅次于大豆)在世界各地廣泛種植。野生的歐洲油菜品種含有大量的芥子酸，這種物質(zhì)會(huì)對(duì)人們的身體健康造成危害。因此，加拿大首先培育出了一種低芥子酸、低芥子油苷的新栽培種Canola［1］。同時(shí)，由于能源危機(jī)和歐洲油菜油燃燒時(shí)低空氣污染及其本身的可再生性，越來(lái)越多的人把歐洲油菜油當(dāng)作生物燃料，使它成為了一種很好的綠色能源。總的來(lái)說(shuō)，油脂和蛋白質(zhì)的含量在歐洲油菜育種過(guò)程中是最重要的目標(biāo)，此外，針對(duì)不同病蟲(chóng)害的抗逆性育種同樣至關(guān)重要。自上世紀(jì)90年代，人們?yōu)閷?shí)現(xiàn)這些目標(biāo)付出了大量心血。例如，基于基因工程花粉控制系統(tǒng)的商業(yè)雜交種生產(chǎn);改良種子中油脂和蛋白質(zhì)的組分以及其他很多方面的努力［2，3］。

由于歐洲油菜有美麗鮮亮的黃色花朵，因此它也可以作為一種觀賞植物。而改變歐洲油菜性狀的方法，可以通過(guò)基因修飾技術(shù)培育出其變種，讓這些變種長(zhǎng)出更大的花朵，擁有更多更穩(wěn)定的花瓣，降低植株的高度并長(zhǎng)出更多的分枝。當(dāng)然，實(shí)現(xiàn)這一切的主要困難是以基因工程手段選擇需要的目的基因并對(duì)其DNA進(jìn)行重組的過(guò)程。本文將對(duì)這些育種目標(biāo)實(shí)現(xiàn)可能性和育種策略進(jìn)行討論。

2.歐洲油菜的生物學(xué)背景

關(guān)于歐洲油菜的栽培歷史可以追溯到公元前1500年，它從北歐直到亞洲中國(guó)和韓國(guó)都有分布。圖1展示了蕓薹屬植物種間的遺傳關(guān)系［4］。從圖1中可知?dú)W洲油菜源于甘藍(lán) (B.oleracea)和蕪菁 (B.rapa)。歐洲油菜的染色體結(jié)合了甘藍(lán)和蕪菁的染色體組，因此它是一個(gè)雙二倍體。

歐洲油菜是異花授粉植物，并且不同變種之間可以進(jìn)行雜交，所以根據(jù)不同的需求其生殖過(guò)程可以很容易的被控制。

圖1 “Triangle of U”顯示蕓薹屬植物種間基因組關(guān)系［4］

眾所周知，同線性現(xiàn)象已經(jīng)在十字花科植物中通過(guò)分子技術(shù)觀察到了，利用擬南芥 (Arabidopsis thaliana)這一模式植物與歐洲油菜間的同線性關(guān)系，將擬南芥作為特定基因的來(lái)源，很多調(diào)控植物生理和形態(tài)特征的基因能夠被識(shí)別和克隆。兩個(gè)歐洲油菜與擬南芥phenylalanine ammonia-lyase 1基因同源的cDNA被Ni等人［5］成功的克隆、鑒定及表達(dá)。

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，提高歐洲油菜觀賞特性的育種目標(biāo)主要以改變花瓣的數(shù)量、改變花朵的大小和植株的高度為主。如果育種目標(biāo)性狀是單基因調(diào)控的，首先要找到擬南芥中控制這些性狀的基因，然后利用基因工程技術(shù) (例如，基因槍法，Ti質(zhì)粒等)［6，7］將這些基因轉(zhuǎn)移到歐洲油菜基因組上，若轉(zhuǎn)基因成功并且能表達(dá)出穩(wěn)定的性狀，那么就可以宣布一個(gè)新的栽培種誕生了;如果目標(biāo)性狀由數(shù)量性狀基因座控制，則可以運(yùn)用一些特殊的育種方法來(lái)獲得這些性狀。

3.育種策略

歐洲油菜觀賞應(yīng)用方面的育種幾乎沒(méi)有任何報(bào)道。針對(duì)這個(gè)育種方向，研究要以油菜的分子標(biāo)記和數(shù)量性狀基因座的分析為基礎(chǔ)，需要知道這些性狀的基本遺傳背景。關(guān)于DNA序列結(jié)構(gòu)、遺傳圖譜、基因標(biāo)記和基因組數(shù)據(jù)等方面已有大量的研究成果［2，8］。正如上面所提到的，十字花科植物中已觀察到同線性，因此，在歐洲油菜的育種策略中可以利用擬南芥研究中與其相關(guān)的成果。

3.1 改變花瓣數(shù)量

由于擬南芥和歐洲油菜之間存在同線性，這一點(diǎn)為這兩個(gè)物種間通過(guò)基因修飾進(jìn)行育種提供了可能性。如經(jīng)典的擬南芥ABC成花模型所述［9—11］:C族基因 AG(AGAMOUS)單獨(dú)作用控制心皮的形成，或者和B族基因一起控制雄蕊形成過(guò)程。如果AG基因發(fā)生突變，那么花朵的生長(zhǎng)將出現(xiàn)變異，雄蕊和心皮將被花瓣和花萼取代并進(jìn)行無(wú)限生長(zhǎng)，產(chǎn)生“花中花”并無(wú)法進(jìn)行有性生殖。育種中可以把AG基因mRNA通過(guò)miRNA和siRNA切斷，進(jìn)而抑制AG基因在歐洲油菜中的表達(dá) (這種方法也可以稱作RNA干擾法)。對(duì)于AG基因的抑制，也可以通過(guò)誘導(dǎo)DNA甲基化影響AG基因的表達(dá)。然而DNA甲基化，在自然遺傳數(shù)代后其效應(yīng)將消失，因此被抑制的AG基因?qū)⒃俅伪磉_(dá)。更好的方法是用RNA干擾法抑制AG基因的表達(dá)，但是這種方法將誘導(dǎo)出完全的不育花，針對(duì)這個(gè)問(wèn)題可以使用無(wú)性繁殖的方法去獲得基因修飾的植株［12］。但這個(gè)方法在大規(guī)模生產(chǎn)中會(huì)增加成本。

獲得抑制AG基因表達(dá)的植株更加可靠的方法是使用雙組分系統(tǒng)［7］。第一步，創(chuàng)建攜帶兩個(gè)重復(fù)的抑制AG基因表達(dá)片段 (siRNA和miRNA)的植株 (親本A)。抑制AG基因表達(dá)片段的啟動(dòng)子是不活躍的，因此AG基因仍然可以在親本A中表達(dá)并且可以遺傳給下一代。第二步，培育出攜帶著兩個(gè)重復(fù)的活化子的植株 (親本B)，這個(gè)活化子是親本A中抑制AG基因表達(dá)片段的啟動(dòng)子并且可以在親本B中持續(xù)表達(dá)。因?yàn)槿笔Я艘种艫G基因表達(dá)片段，AG基因仍然可以在親本B中表達(dá)并且植株是可育的。親本A和親本B的純合系一旦建立，就可使其雜交，F(xiàn)1代植株將攜帶一個(gè)重復(fù)的抑制AG基因表達(dá)片段和一個(gè)重復(fù)的活化子，抑制AG基因表達(dá)片段即可被活化，表現(xiàn)出AG基因缺失性狀。

另外，物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)歐洲油菜基因突變，使其擁有插入或缺失的特定序列，也可導(dǎo)致花瓣數(shù)量的變化。但誘導(dǎo)突變?cè)谌旧w上發(fā)生的位置是隨機(jī)的，這種方法需要大量的植株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，期望得到的是花瓣數(shù)量改變的突變體，這將消耗大量的時(shí)間和金錢。此外突變的植株可能是不育的，因此還需要用無(wú)性繁殖去解決這個(gè)問(wèn)題，這將增加額外的開(kāi)支。

3.2 改變花瓣大小

花瓣的大小依賴于基因組特征并且具有高度的遺傳性，花瓣大小的遺傳性高達(dá)96.3%［13］。以往的研究表明，控制花瓣大小的基因?qū)儆诩有曰颍鐖D一所示，在AA背景上每增加一個(gè)C，花瓣的長(zhǎng)度就增加4—5mm。歐洲油菜基因組便有此結(jié)構(gòu)，因此它是自然界中花瓣最大的蕓薹屬植物。更詳細(xì)的解釋為B.oleracea var.alboglabra cv.Kairan(C11C11)與 B.rapa var.chinensis cv.Kosaitai(A15A15)雜交得到雙二倍體的歐洲油菜 (C11C11A15A15)［4］。若使用多倍體育種技術(shù)將親本的染色體加倍得到四倍體植物并將它們雜交，則可得到更大花瓣的植株。

3.3 改變植株高度

歐洲油菜植株高度是一定的。在自然界中，過(guò)高的歐洲油菜不能作為觀賞品種，其過(guò)長(zhǎng)的莖節(jié)使其看起來(lái)顯得瘦長(zhǎng)，因此會(huì)影響其觀賞品質(zhì)。若其高度被數(shù)量性狀基因座控制，育種中就可用選擇育種法挑選性狀矮小的植株。與其他影響觀賞品質(zhì)的性狀一樣，植株高度的數(shù)量性狀基因座在染色體中的位置已經(jīng)繪制出來(lái)［14］。了解每一種性狀對(duì)應(yīng)數(shù)量性狀基因座的位置，便可用基因標(biāo)記法很容易的選擇出目的基因［15］。此外，單倍體育種也可以降低植株的高度［16］，但這種方法會(huì)與增加花瓣大小這一目標(biāo)相矛盾，因?yàn)閱伪扼w植株所有的性狀都會(huì)減弱并且其都是不育的。

4.討論與展望

結(jié)合育種目標(biāo)，改變歐洲油菜觀賞性狀的育種全過(guò)程為:第一步，調(diào)節(jié)植株高度的同時(shí)增加花瓣的大小;第二步，使用分子生物技術(shù)增加花瓣的數(shù)量;最后，選擇出成功基因修飾過(guò)的植株作為雜交育種的親本。在這些階段的實(shí)施過(guò)程中，一些目的性狀之間可能相互影響甚至相互沖突。例如，單倍體植株不能用作雜交育種的親本，而單倍體或四倍體植株在降低植株高度和增加花瓣大小上表現(xiàn)出相反的效果。然而，可以通過(guò)創(chuàng)造具有單一性狀的純合植株，將其雜交獲得目的性狀。

在自然界中，植物的進(jìn)化過(guò)程可能會(huì)出現(xiàn)一些育種需要的性狀。如果能夠模仿自然界中的條件并且研究清楚植物進(jìn)化的機(jī)制，那么就可以直接誘導(dǎo)植物朝著育種的目標(biāo)性狀變化。

除了上述目標(biāo)性狀外，花期的長(zhǎng)短，開(kāi)花的長(zhǎng)日照和短日照條件和花色等性狀在未來(lái)的育種目標(biāo)中也應(yīng)該考慮到［17］。

在改變歐洲油菜觀賞特性的育種過(guò)程中存在很多的困難，最主要的困難是無(wú)法預(yù)測(cè)通過(guò)基因修飾來(lái)增加花瓣數(shù)量這一方法是否能成功。另外，正常情況下基因修飾過(guò)的性狀穩(wěn)定性也是很低的，這就要求選擇育種的系統(tǒng)必須是十分科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?。雖然面對(duì)很多的困難，但歐洲油菜與擬南芥十分接近的親緣關(guān)系及大量擬南芥的研究基礎(chǔ)提供了歐洲油菜育種過(guò)程中的理論依據(jù)，并且隨著生物技術(shù)和育種技術(shù)的不斷發(fā)展，使改變歐洲油菜觀賞特性的育種目標(biāo)變?yōu)榭赡堋?/p>

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