管春平，何艷嬌，徐成東

(楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，云南 楚雄 675000)

黃酮類化合物 (flavones compounds)泛指兩個苯環(huán) (A與B)通過三個碳原子相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物［1］，主要包括黃酮、黃酮醇、異黃酮、二氫黃酮、查耳酮等，廣泛存在蔬菜、水果、牧草、漿果和藥用植物中，大約有4千多種。黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，可以改善血液循環(huán)、降低膽固醇、抑制炎性生物酶的滲出、增進(jìn)傷口愈合和止痛，它還具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可有效清除體內(nèi)的氧自由基［2］。

滇大薊［3］(Cirsium chlorolepis Petrak)，菊科薊屬多年生草本野生藥用植物，在滇中大部分地區(qū)有分布，生長于山坡或田野溝邊、路旁。滇大薊的營養(yǎng)及藥用價值極高，可作蔬菜煮食，具清涼、消炎作用;入藥能涼血、止血、散瘀、治吐血、咯血等癥，主要含有黃酮和黃酮苷，三萜類、甾體類、揮發(fā)油類等化學(xué)成分［4］。滇大薊在云南代替大薊入藥［5］，從中提取黃酮還尚未見相關(guān)研究報道。探究滇大薊中黃酮的提取條件及提取液對羥基自由基的清除作用，有利于滇大薊資源的開發(fā)，為今后滇大薊的利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器

1.1.1 材料

滇大薊，采于云南石林縣，經(jīng)楚雄師范學(xué)院徐成東教授鑒定為菊科薊屬植物滇大薊。

1.1.2 試劑

無水乙醇、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、水楊酸、氫氧化鈉、鋅粉、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、硝酸鋁、雙氧水、濃氨水、三氯化鐵、鹽酸、BHT(二丁基羥基甲苯)，以上試劑為分析純;蒸餾水。

準(zhǔn)確稱取干燥恒重蘆丁10mg，加適量70%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，定容，搖勻，得濃度為0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.1.3 儀器

722S型光柵分光光度計 (山東高密分析儀器廠)、CP214C電子天平 (奧豪斯儀器有限公司)、HH—S2S恒溫水浴鍋 (金壇市大地自動化儀器廠)、DFY－500型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理

滇大薊洗凈→曬干→粉碎→備用。

1.2.2 黃酮類化合物的提取

稱取4.0g滇大薊粉末，置于圓底燒瓶中，加入50.0mL70%乙醇溶液，裝上冷凝裝置，在70℃下恒溫水浴2h，過濾，制得提取液。

1.2.3 提取液的定性檢驗［6］

鋁鹽反應(yīng):取提取液1.0mL于試管中，加入幾滴1%硝酸鋁溶液，振蕩。若溶液顏色顯黃色，則說明提取液中含有黃酮。

濃氨水反應(yīng):取提取液1.0mL于試管中，加入幾滴濃氨水溶液，振蕩。若溶液顯亮黃色，則說明提取液中含有黃酮。

氫氧化鈉反應(yīng):取提取液1.0mL于試管中，加入幾滴4%氫氧化鈉溶液，振蕩。若溶液顯亮黃色，則說明提取液中含有黃酮。

乙酸鉛反應(yīng):取提取液1.0mL于試管中，加入幾滴乙酸鉛溶液，振蕩。若有黃色沉淀產(chǎn)生，則說明提取液中含有黃酮。

濃硫酸反應(yīng):取提取液1.0mL于試管中，加入幾滴濃硫酸，振蕩。若有溶液顯黃色或橙色，則說明提取液中含有黃酮。

1.2.4 黃酮含量的測定［7］

準(zhǔn)確吸取 0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00 mL，0.50mL，1.00mL，1.50mL，2.00mL，2.50mL，3.00mL分別置于25mL比色管中，各加入5%NaNO20.30mL，搖勻，放置6min;加10%Al(NO3)30.30mL，搖勻，放置6min;加4%NaOH 4.00mL，用70%乙醇溶液定容到10mL刻度線，搖勻，放置10min后，以試劑空白為參比，在510nm波長下測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得回歸方程。

準(zhǔn)確吸取滇大薊樣品液1.00mL于25mL比色管中，順序加入5%NaNO20.30mL、10%Al(NO3)30.30mL、4%NaOH 4.00mL，用同濃度乙醇定容到10mL，在510nm波長處以試劑空白作為參比測定吸光度。

將所測吸光度代入回歸方程，求出樣品液中黃酮濃度，按下式計算黃酮提取得率:

黃酮提取得率 (%)=［(C×V×n)/(M×1000)］×100% (1—1)

式中:C—樣品液中黃酮的濃度 (單位:mg/mL);V—樣品液體積 (單位mL);n—稀釋倍數(shù);M—滇大薊粉末的質(zhì)量 (單位:g)。

1.2.5 提取條件的單因素實驗

稱取3.0g滇大薊粉末，按1.2.2方法提取黃酮，過濾，濾液轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，并用相應(yīng)乙醇定容，制得樣品液。按1.2.4方法顯色后，在510nm波長處測定其吸光度，平行實驗三次。分別進(jìn)行乙醇濃度、料液比、提取溫度及提取時間的選擇。

1.2.6 最佳提取條件的選擇

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(34)正交實驗，確定最佳提取條件。

1.2.7 滇大薊提取液對羥基自由基 (·OH)的清除作用［8—9］

參照Fenton反應(yīng)［10］的方法建立反應(yīng)體系模型。采用固定反應(yīng)時間法，在510nm波長處測反應(yīng)液的吸光度，并與空白液比較。

反應(yīng)體系為:在10mL比色管中加入9mmol/LFeSO4溶液2.00mL，9mmol/L水楊酸－乙醇溶液2.00mL，不同體積的滇大薊提取液，最后加8.8mmol/LH2O22.00mL啟動反應(yīng)，加蒸餾水定容，將反應(yīng)體系置于37℃的水浴中反應(yīng)30min，以蒸餾水為參比，以試劑空白作比較，在510nm處測定吸光度。考慮到提取液自身的吸光度，在10mL比色管中加入9mmol/LFeSO4溶液2.00mL，9mmol/L水楊酸－乙醇溶液2.00mL，不同體積的滇大薊提取液，加蒸餾水定容，反應(yīng)體系也置于37℃的水浴中反應(yīng)30min，作為提取液的本底吸收。重復(fù)實驗三次，并與BHT溶液和蘆丁溶液為對照，比較三者對羥自由基的清除能力。

清除率計算公式:·OH清除率 (%)={［A0－ (Ax－Ax0)］/A0}×100% (1—2)

式中:A0—空白對照溶液吸光度;Ax—提取液吸光度;Ax0—不加H2O2的提取液的本底吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液定性檢驗結(jié)果

按1.2.3對滇大薊提取液進(jìn)行定性檢驗，結(jié)果如表2—1所示。

表2—1 提取液定性檢驗結(jié)果

由表2—1結(jié)果可看出，滇大薊的提取液與上述試劑的反應(yīng)現(xiàn)象和黃酮與這些試劑的反應(yīng)現(xiàn)象相吻合，說明滇大薊的提取液中含有黃酮類化合物。

2.2 黃酮含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.2.4進(jìn)行實驗，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2—1所示。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程:A=9.9429C－0.00314，R=0.9998。

2.3 提取條件的單因素實驗結(jié)果

按1.2.5方法進(jìn)行實驗，結(jié)果如圖2—2、如圖2—3、如圖2—4、如圖2—5所示。

圖2—1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2—2 乙醇濃度的選擇

由圖2—2可看出，在其他條件不變的情況下，樣品液的吸光度隨乙醇溶液濃度的增大而增高，當(dāng)乙醇溶液濃度為60%時達(dá)到最大值，此后隨著乙醇溶液濃度的升高，樣品液吸光度下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60% 時，高濃度的乙醇反而會導(dǎo)致原料細(xì)胞膜性狀改變而使得總黃酮難以從細(xì)胞中提出，從而導(dǎo)致黃酮提取得率降低［11］。故選用60%的乙醇溶液作提取劑較適宜。

圖2—3 料液比的選擇

圖2—4 提取溫度的選擇

由圖2—3可看出，在其他條件不變的情況下，滇大薊中黃酮的提取得率隨料液比的增大而增大，當(dāng)料液比為1∶30時黃酮提取得率最大，此后隨著料液比的增大，提取得率下降，因此，從滇大薊中提取黃酮時宜采用1∶30的料液比。

由圖2—4可看出，在其他條件不變的情況下，樣品液的吸光度隨著提取溫度的升高而增大，70℃時到達(dá)最大，此后隨著提取溫度的升高，樣品液吸光度降低。原因是溫度過高，一些蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)大量溶出，導(dǎo)致提取液粘性加大，雜質(zhì)溶出量增加，從而導(dǎo)致提取率下降［11］，近而導(dǎo)致樣品液吸光度降低，因此，從滇大薊中提取黃酮時提取溫度選用70℃較為適宜。

圖2—5 提取時間的選擇

由圖2—5可看出，在其他條件不變的情況下，樣品液的吸光度隨著提取時間的增加而增大，在3h時達(dá)到最大值，此后隨著提取時間的增長，樣品液吸光度下降。因此，從滇大薊中提取黃酮時提取時間選用3h較為適宜。

2.4 最佳提取條件的選擇

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，進(jìn)行L9(34)正交實驗。選定的正交實驗因素如表2—2，正交實驗結(jié)果如表2—3所示。

表2—2 正交實驗因素水平表

表2—3 正交實驗結(jié)果

從表2—3可以看出，四個因素對滇大薊中黃酮提取得率的影響程度是C(提取溫度)﹥A(乙醇濃度)﹥D(提取時間)﹥B(料液比)，最佳提取條件為A2B2C3D3，即:乙醇濃度為60%，料液比為1∶30，提取溫度為80℃，提取時間4h。

在最佳提取條件下進(jìn)行三次平行實驗，結(jié)果如表2—4所示。

表2—4 最佳提取條件下實驗結(jié)果

由表2—4可知，在最佳條件下提取黃酮，平均提取得率可達(dá)0.163%。

2.5 滇大薊提取液對羥基自由基 (·OH)的清除作用結(jié)果

按1.2.7方法進(jìn)行實驗，結(jié)果如圖2—6所示。

由圖2—7可知，同濃度同體積的滇大薊提取液、蘆丁溶液和BHT溶液對羥基自由基的清除能力為:滇大薊提取液＞蘆丁溶液＞BHT溶液，滇大薊提取液的清除效果較好。

圖2—6 滇大薊提取液、蘆丁溶液和BHT對羥自由基的清除

3 結(jié)論

用乙醇作為提取劑提取滇大薊中的黃酮，最佳提取條件為:60%的乙醇溶液，料液比1∶30(g/mL)，提取溫度為80℃，提取時間為4h，在此條件下，黃酮提取率可達(dá)0.163%。

同濃度同體積的滇大薊提取液、蘆丁溶液和BHT(二丁基羥基甲苯)溶液對羥基自由基(·OH)的清除效果為:提取液＞蘆丁溶液＞BHT溶液，表明滇大薊提取液能較好的清除羥基自由基。

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