朱智勇 馬穎才 唐 莉 榮光宏 (青海省人民醫(yī)院消化科，青海 西寧 810007)

研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)以及己糖激酶-Ⅱ(HK-Ⅱ)在體內(nèi)的高表達(dá)能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解，起到良好的抗癌作用〔1〕。本研究分析不同氧濃度對HIF-1α及HK-Ⅱ表達(dá)的影響，并觀察HK-Ⅱ的表達(dá)與乳酸分泌之間的聯(lián)系，探討HIF-1α及HK-Ⅱ在腫瘤缺氧耐受機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TEl3和Ecal09，其中TEl3/shRNA細(xì)胞為 TEl3的HIF-1α穩(wěn)定干擾株，Ecal09/shRNA細(xì)胞為Ecal09的HIF-1α穩(wěn)定干擾株。逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)箱和缺氧培養(yǎng)箱、定量PCR儀、紫外分光光度儀以及乳酸濃度測定試劑盒、TRIzol、SYBR Green I RT-PCR Master Mix等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)及分組 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。首先將細(xì)胞放置于胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，待細(xì)胞生長至60%融合時(shí)取出，饑餓24 h。之后更換培養(yǎng)液，可以為無血清培養(yǎng)液。對細(xì)胞進(jìn)行分組，觀察組采用1%氧濃度，對照組采用20%氧濃度。觀察兩組細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h后的HIF-1α及HK-Ⅱ表達(dá)情況。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR 利用TRIzo1提取總RNA，然后使用RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，之后使用SYBR Green熒光染料進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為50℃ 5 min，95℃ 3 min，95℃ 20 s，60℃ 1 min，55個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后測定吸光度(A)值。隨著PCR系統(tǒng)在每一個(gè)循環(huán)結(jié)束后測定A值，得到以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)、A值為縱坐標(biāo)的定量曲線。

1.2.3 分光光度法測定乳酸濃度 取細(xì)胞培養(yǎng)上清液以分光光度法測定乳酸濃度。空白管加蒸餾水0.02 ml，標(biāo)準(zhǔn)管加3 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液0.02 ml，測定管加樣本0.02 ml，各管中均加入酶工作液1 ml及顯色劑0.2 ml，混勻后37℃水浴反應(yīng)10 min，各管加終止液2 ml。混勻，530 nm，1 cm 光徑，蒸餾水調(diào)零，分光光度儀測各管A值，根據(jù)空白管、標(biāo)準(zhǔn)管及測定管的A值計(jì)算得出細(xì)胞培養(yǎng)上清液的乳酸濃度(mmol/L)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α和 HK-ⅡRNA在 TEl3/shRNA及 Ecal09/shRNA中的表達(dá) 常氧(20%氧濃度)條件下被干擾的TEl3/shRNA和Ecal09/shRNA細(xì)胞中 HIF-1α RNA表達(dá)量較未干擾的TEl3、Ecal09細(xì)胞明顯減弱(P＜0.01)。而各細(xì)胞株 HIF-1α RNA表達(dá)量在常氧和缺氧(1%氧濃度)條件下差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HK-ⅡRNA表達(dá)結(jié)果與HIF-1α RNA一致。見表1。

2.2 各組細(xì)胞乳酸分泌量比較 未干擾的TEl3、Ecal09細(xì)胞缺氧后乳酸分泌量較常氧培養(yǎng)時(shí)明顯增多，被干擾的TEl3/shRNA、Ecal09/shRNA細(xì)胞乳酸分泌量較TEl3、Ecal09細(xì)胞顯著減少(P＜0.01)。見表2。

表1 各組細(xì)胞HIF-1α和HK-ⅡRNA表達(dá)(±s)

表1 各組細(xì)胞HIF-1α和HK-ⅡRNA表達(dá)(±s)

與20%氧濃度TEl3比較:1)P＜0.01;與20%氧濃度Ecal09比較:2)P＜0.01;與各組細(xì)胞20%氧濃度比較:3)P＜0.01;下表同

細(xì)胞株 氧濃度 HIF-1α HK-ⅡRNA TEl3 20% 1.000±0.016 1.000±0.137 1% 1.128±0.158 1.438±0.1783)TEl3/shRNA 20% 0.689±0.1041) 0.409±0.0141)1% 0.738±0.138 0.521±0.0413)Ecal09 20% 1.000±0.113 1.000±0.169 1% 1.252±0.176 1.331±0.1283)Ecal09/shRNA 20% 0.505±0.0612) 0.475±0.0672)1% 0.743±0.138 0.516±0.0323)

表2 各組細(xì)胞乳酸含量比較(±s ，mmol/L)

表2 各組細(xì)胞乳酸含量比較(±s ，mmol/L)

氧濃度TEl3 Ecal09 TEl3/shRNA Ecal09/shRNA 20% 6.891±1.592 6.070±1.839 2.704±0.9432)2.375±0.8403)1% 15.062±3.9011)14.707±3.5941)4.982±1.953 2.214±0.982

3 討論

目前研究認(rèn)為〔2〕，人體內(nèi)提供細(xì)胞能量的主要來源是葡萄糖的代謝。糖代謝能夠通過線粒體氧化磷酸化及糖酵解兩種方式提供細(xì)胞ATP，維持細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)〔3〕。糖酵解是腫瘤細(xì)胞主要產(chǎn)生能量的方式。有研究報(bào)道〔4～6〕，無論是在正常氧濃度下還是在低氧濃度下，糖酵解均能為腫瘤細(xì)胞提供主要的能量。特別是在某些低氧情況下，糖酵解過程加強(qiáng)，某些腫瘤細(xì)胞能夠很快適應(yīng)低氧情況，增強(qiáng)糖酵解的能力，以維持自身的能量供應(yīng)〔7〕。目前對糖酵解和腫瘤的聯(lián)系有以下觀點(diǎn)〔8～10〕:(1)糖酵解過程中產(chǎn)生的能量能為腫瘤細(xì)胞提供相應(yīng)ATP;(2)糖酵解產(chǎn)生大量乳酸導(dǎo)致微環(huán)境酸化，酸化的細(xì)胞外液分解破壞細(xì)胞外基質(zhì)，有利于腫瘤細(xì)胞的浸潤，且一些內(nèi)源性免疫細(xì)胞、免疫分子在明顯酸化的條件下均會失效;(3)糖酵解生成的中間代謝產(chǎn)物用于合成蛋白質(zhì)和脂肪，以滿足腫瘤細(xì)胞活躍的合成代謝需求。因此，糖酵解酶具有拮抗細(xì)胞凋亡的功效，導(dǎo)致惡性腫瘤對放射、化學(xué)治療等促凋亡作用的耐受。

HIF-1α通過對缺氧誘導(dǎo)基因表達(dá)的調(diào)控，維護(hù)人體對低氧濃度的反應(yīng)及適應(yīng)能力。有研究報(bào)道表明〔11，12〕，改變?nèi)毖鯐r(shí)間和氧氣的濃度能夠顯著影響小鼠肺平滑肌細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，人食管鱗癌中HIF-1α蛋白的表達(dá)受環(huán)境氧濃度的高度調(diào)控，提示HIF-1α在食管癌細(xì)胞缺氧耐受機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用。研究報(bào)道稱〔13〕，腫瘤患者體內(nèi)HK-Ⅱ的表達(dá)較正常人呈明顯上升趨勢，而且HK-Ⅱ往往是以與線粒體結(jié)合的形式存在，因此能夠加速腫瘤細(xì)胞內(nèi)糖代謝速率，為其提供足夠的能源。本研究結(jié)果說明低氧時(shí)HK-Ⅱ啟動子存在激活反應(yīng)，這與國外學(xué)者在肌肉細(xì)胞及肝癌細(xì)胞系A(chǔ)S-30D中的研究基本一致。乳酸是糖酵解過程中的最終產(chǎn)物，由于腫瘤細(xì)胞的糖酵解得到加強(qiáng)，因此在腫瘤細(xì)胞中可見大量乳酸。根據(jù)本研究結(jié)果認(rèn)為HIF-1α參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的糖酵解過程，而HK-Ⅱ可能為HIF-1α的靶基因。

綜上所述，低氧情況下，人食管鱗癌中HIF-1α及HK-Ⅱ的含量均顯著上升，而HIF-1α表達(dá)下降可以下調(diào)HK-Ⅱ的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞糖酵解水平下降。腫瘤細(xì)胞具有更高的糖酵解水平與其在缺氧微環(huán)境下HIF-1α上調(diào)糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的基因表達(dá)有關(guān)，是腫瘤細(xì)胞耐受缺氧的機(jī)制之一。

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