王建杰 羅文哲 苗 智 閆冬梅 王茉琳 (佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

丹皮酚是牡丹皮中的主要活性成分〔1〕，能抑制某些腫瘤細(xì)胞的增殖，如人白血病細(xì)胞株K562，人肝癌細(xì)胞株Bel-7404，人宮頸癌細(xì)胞株 HeLa以及人大腸癌細(xì)胞株HT-29〔2～4〕。并能夠增強(qiáng)化療藥物順鉑抗食管癌的作用〔5〕。本課題組應(yīng)用丹皮酚處理EMT6(小鼠乳腺浸潤性導(dǎo)管癌)小鼠實(shí)體瘤，證明了丹皮酚能很好地抑制腫瘤生長，并揭示其抗腫瘤機(jī)制是誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡〔6〕。但小鼠與人之間存在著種屬特異性，因此本文選取體外培養(yǎng)的人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞MDA-MB-435作為研究對象，進(jìn)一步觀察丹皮酚對人MDA-MB-435細(xì)胞生長的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑藥品 丹皮酚來自沈陽藥科大學(xué)提純分離，純度＞98%。RPMI1640培養(yǎng)液購于Gibco公司，胎牛血清來源于Hyclone公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、蘇木精、伊紅為北京拜爾迪生物技術(shù)公司產(chǎn)品。二甲基亞砜(DMSO)為Sigma Aldrich Inc公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀，Epics-XLⅡ型，美國Becton Dickinson公司;熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)為德國萊卡公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人MDA-MB-435細(xì)胞以適量濃度接種于9 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，每2～3天傳代1次。實(shí)驗均于細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行。

1.2.2 MTT法檢測丹皮酚對MDA-MB-435細(xì)胞增殖活性的影響 對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞以0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至 5 ×104～1 ×105/ml，并接種于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔 100 μl，培養(yǎng) 24 h，加入不同濃度(7.81、15.63、31.25、62.5、125、250 mg/L)的丹皮酚，每個濃度均設(shè)4個平行孔，用RPMI1640完全培養(yǎng)液作為陰性對照組，同時設(shè)空白調(diào)零，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5 mg/ml的 MTT 20 μl，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，加入 200 μl DMSO 溶液，振蕩10 min后于酶標(biāo)儀492 nm處測OD值，計算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率(%)=(1－實(shí)驗組OD值/對照組OD值)×100。

1.2.3 蘇木素-伊紅(HE)染色檢測丹皮酚對MDA-MB-435細(xì)胞形態(tài)的影響 處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化，RPMI1640完全培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，濃度為5×105個/ml。將細(xì)胞爬片置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入2 ml細(xì)胞懸液，24 h后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加入60 mg/L的丹皮酚，陰性對照組加2 ml RPMI1640完全培養(yǎng)液，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，吸盡培養(yǎng)液，取出細(xì)胞爬片，置于4%多聚甲醛固定液中，4℃過夜。常規(guī)HE染色。梯度酒精脫水，樹膠封片，光鏡下觀察拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測MDA-MB-435細(xì)胞周期 將對數(shù)生長期細(xì)胞均勻接種于6孔板，60 mg/L藥物處理24、48 h。胰酶消化液進(jìn)行消化，收集細(xì)胞于1.5 ml離心管中。1 500 r/min離心5 min，用75%酒精細(xì)胞重懸，洗滌細(xì)胞1次。再加入1 ml乙醇固定細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，結(jié)果以CellQuest軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對細(xì)胞增殖活性的影響 丹皮酚處理MDA-MB-435細(xì)胞 24 h的 IC50高于 250 mg/L，而 48 h后的 IC50約為60 mg/L，說明丹皮酚作用48 h后對MDA-MB-435細(xì)胞增殖具有直接抑制作用，并呈劑量依賴性。

2.2 丹皮酚處理后MDA-MB-435細(xì)胞形態(tài)學(xué) 細(xì)胞爬片經(jīng)HE染色，光鏡下可見對照組的MDA-MB-435細(xì)胞生長良好，細(xì)胞呈多邊形，胞漿多，胞核染色質(zhì)疏松，染色較淡。而丹皮酚處理MDA-MB-435細(xì)胞24、48 h后，細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，出現(xiàn)細(xì)胞胞體變圓，體積縮小，胞漿起泡，部分細(xì)胞浮起，胞膜皺縮染色質(zhì)凝集，核深染等形態(tài)變化。見圖1。

2.3 細(xì)胞周期分析 60 mg/ml丹皮酚處理24 h和48 h后，MDA-MB-435細(xì)胞在G0/G1期的百分?jǐn)?shù)增加，而S期和G2/M細(xì)胞數(shù)減少，說明丹皮酚阻滯細(xì)胞周期從G1到S期的轉(zhuǎn)化。此外，在丹皮酚處理24、48 h后，均出現(xiàn)了Sub-G1期，與對照組比較差異顯著(P＜0.01)。見圖2。

圖1 丹皮酚(60 mg/L)對MDA-MB-435細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(HE，×200)

圖2 丹皮酚(60 mg/L)處理后MDA-MB-435細(xì)胞周期結(jié)果

3 討論

本結(jié)果顯示丹皮酚能夠明顯抑制MDA-MB-435細(xì)胞增殖。腫瘤細(xì)胞的最基本特征是細(xì)胞的失控性生長，而失控性增殖的根本原因就是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的破壞。腫瘤細(xì)胞增殖快慢主要取決于細(xì)胞G0/G1期的長短。G0/G1期短，腫瘤細(xì)胞增殖快，處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)少〔7〕。文獻(xiàn)報道，當(dāng)細(xì)胞生長阻滯在G1期達(dá)到一定程度和時間后，仍不能解除阻滯將會使細(xì)胞無法進(jìn)入S期，則激活細(xì)胞內(nèi)的某種機(jī)制，啟動程序性細(xì)胞死亡，從而引發(fā)凋亡〔8〕。本文中阻滯于細(xì)胞周期從G1到S期，表明丹皮酚影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制和合成，抑制細(xì)胞的正常分裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。凋亡細(xì)胞的DNA在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下裂解成180～200 bp或與之成整數(shù)倍的寡核苷酸片段，經(jīng)過染色后顯示DNA峰值時，會在正常二倍體DNA峰(G1)之前出現(xiàn)一個亞二倍體峰(Sub-G1峰)，即凋亡峰。本實(shí)驗丹皮酚處理24、48 h后，即出現(xiàn)了凋亡峰?？梢姷てし幼铚?xì)胞周期在G0/G1期，并誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡，由此說明丹皮酚發(fā)揮抗癌作用的重要機(jī)制之一可能是影響了細(xì)胞周期和誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

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2 潘顯道，費(fèi)勤志，朱承根，等.5個丹皮酚酯的合成和體外抗腫瘤活性研究〔J〕.安徽醫(yī)藥，2004;8(1):16-8.

3 劉長青，譚詩云，計春燕，等.丹皮酚對大腸癌HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用及其機(jī)制的探討〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2005;21(10):1251-4.

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6 Mimura K，Baba S.Determination of paeonol metabolites in man by the use of stable isotopes〔J〕.Chem Pharm Bull，1981;29(7):2043-50.

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