郭 齊 李玉森 陳 強(qiáng) 霍志剛 (山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 濟(jì)南 25002)

腎臟缺血-再灌注時(shí)，腎小管、腎小球等相關(guān)臟器細(xì)胞均存在缺氧環(huán)境，長時(shí)間的缺氧，可能誘發(fā)腎臟細(xì)胞的衰老及凋亡，現(xiàn)有研究證實(shí)，衰老、凋亡的重要途徑可能與JAK2-STAT的激活有關(guān)〔1〕。臟器細(xì)胞的凋亡，衰老，導(dǎo)致腎臟功能逐步下降，出現(xiàn)蛋白尿、血尿、BUN、SCr增加，最終發(fā)展為腎臟衰竭。流行病學(xué)調(diào)查〔2〕顯示腎衰竭患者患病率逐漸增加，至2012年我國已有近400萬腎衰竭患者，因此其已成為人類最主要的公眾健康問題之一，腎衰竭患者生活質(zhì)量低下，長期透析不僅增加社會或個(gè)人的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，另外其心血管并發(fā)事件及腎功能持續(xù)下降最終使得患者死亡。因此腎功能失代償期之前的缺血、缺氧所導(dǎo)致的腎臟細(xì)胞的衰老、凋亡是腎病治療中的關(guān)鍵一步?，F(xiàn)已證實(shí)脫氧核苷酸具有一定的抗衰老、抗凋亡作用〔3〕，可能對腎臟細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。本研究采用體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)合的方式，探究脫氧核苷酸的抗衰老、抗凋亡作用，并試圖揭示脫氧核苷酸保護(hù)腎臟的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 SDS-PAGE、(Therom，美國);光學(xué)顯微鏡及取圖系統(tǒng)(奧林巴斯，美國)，低溫微量離心機(jī)(Eppendor公司，德國);酶標(biāo)儀(島津，日本);液氮罐及低溫冰箱(Thermo公司，美國)，小型流式細(xì)胞儀10 cm(BD，美國)。IMDM 培養(yǎng)基(青霉素 100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，胰酶(美國Hyclone公司);二甲基亞礬(DMSO);兔抗人Bax多克隆抗體，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IG，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IG，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，免疫組化試劑盒(Sigma);STAT1及 STAT3單克隆抗體，pSTAT1及pSTAT3單克隆抗，叔丁基過氧化氫;TRITC標(biāo)記二抗;內(nèi)參山羊抗人β-actin多克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(美國Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外實(shí)驗(yàn) (1)MTT法〔4〕、JAK2-STAT、bcl-2/bax相關(guān)蛋白檢測〔5〕:近曲腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)用含10% 小牛血清的IMDM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞生成面積為80% ～90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，PBS沖洗，調(diào)節(jié)濃度為2×105/ml，并接種于96孔平底培養(yǎng)板，2×104/孔。分為3組，每組4復(fù)孔，即正常對照組，脫氧核苷酸組，模型組。其中脫氧核苷酸組及模型組各孔均加入含有一定濃度CoCl2的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)脫氧核苷酸組加入20 μg/ml脫氧核苷鈉缺氧培育24 h，加入50 μl完全培養(yǎng)液和10 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液共同孵育4 h。吸去上清液，每孔加入150 μl DMSO，室溫下，將96孔板置于微振器上振蕩 10 min。在酶聯(lián)檢測儀上測波長570 nm光密度(OD)值，并計(jì)算缺氧細(xì)胞生長細(xì)胞抑制率。同時(shí)吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用4 ml預(yù)冷PBS，磷酸酶抑制劑沖洗，棄之再加入1 ml預(yù)冷PBS磷酸酶抑制劑，并轉(zhuǎn)移知預(yù)冷的1 mlEppendorf管中，并準(zhǔn)備電泳成像，主要步驟包括提取核蛋白、應(yīng)用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，配制SDS-PAGE凝膠的配制、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、顯影等。(2)細(xì)胞凋亡試驗(yàn)〔6〕:對數(shù)生長期細(xì)胞接種每孔1×106/ml接種于無菌6孔板中，2 ml/孔，培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為三組，分別進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)措施，繼續(xù)培養(yǎng)48 h、消化，制成細(xì)胞懸液，收集于 15 ml離心管，4℃預(yù)冷的 PBS沖洗 3次，1 000 r/min離心10 min，棄上清，緩沖液調(diào)節(jié)濃度為1×106/ml，取100 μl置于5 ml流式管，加入 sulFITC-AnnexinV 和 sulPl雙標(biāo)記，混勻溫育15 min，繼續(xù)加入400 μl×Binding緩沖液，采用BD小型流式細(xì)胞儀檢測進(jìn)行定量分析，并采用Multicyder for windows分析軟件行雙參數(shù)分析。

1.2.2 動物實(shí)驗(yàn)〔7〕30只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為三組，假手術(shù)組，脫氧核苷酸組，模型組，每組各10只。脫氧核苷酸組及模型組大鼠均采用5% 水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，選取大鼠背部左側(cè)作為手術(shù)部位，切開并暴露左腎，鈍性分離腎臟包膜，于左腎的上下極各1/3切除，止血，結(jié)扎，縫合傷口，給予正常飲水、飲食。術(shù)后10 d，采用同樣手術(shù)方法，結(jié)扎腎蒂，摘除右腎，脫氧核苷酸組隨后每日靜脈推注50 mg脫氧核苷酸鈉，模型組推注生理鹽水。假手術(shù)組除不切除或摘除腎外，處理方式與另外兩組相似，術(shù)后推注0.9%生理鹽水，于第2次手術(shù)，30 d后處死動物，處死前1 d，大鼠置于代謝籠中(禁食，不禁水)，收集24 h尿液測尿液檢查尿蛋白，處死時(shí)，取血，檢測血尿素氮 (BUN)、肌酐(SCr)。并取左腎組織，置于4%中性福爾馬林溶液中固定，并采用石蠟包埋，制作病理切片并進(jìn)行免疫組化檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0醫(yī)學(xué)軟件包分析，計(jì)量數(shù)值均采用±s表示，行方差分析，若方差齊性則采用t檢驗(yàn)，若方差不齊性采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長抑制率 MTT法檢測顯示正常對照組無細(xì)胞生長抑制發(fā)生，模型組抑制率達(dá)到40.2% ±11.4%，脫氧核苷酸組為13.46% ±7.7%，三組間顯著差異(P＜0.05)。見圖1。

2.2 脫氧核苷酸對細(xì)胞凋亡的影響 圖2可見，正常對照組凋亡率僅有(6.56±1.09)%，而模型組凋亡率高達(dá)(26.4±2.58)%，脫氧核苷酸干預(yù)組凋亡率為(10.8±1.44)%。三組差異顯著(P＜0.05)。正常對照組Bcl-2蛋白表達(dá)的積分光密度值(IOD)為(31.97±4.29)，而脫氧核苷酸組(24.66±4.59)與模型組(14.08±2.8)表達(dá)均顯著下降，模型組下降更明顯(P＜0.05)。另外Bax蛋白，正常對照組表達(dá)(29.68±3.30)則顯著低于模型組(109.83±14.3)及脫氧核苷酸組(44.69±6.71)，模型組增高更明顯(P＜0.05)。

圖2 Bcl-2蛋白及Bax蛋白表達(dá)情況(×400)

2.3 脫氧核苷酸對JAK2/STAT信號通路的影響 缺氧處理后的 STAT1，P-STAT1，STAT3，P-STAT-3蛋白的表達(dá)均較正常對照組有顯著地增強(qiáng)，細(xì)胞衰老明顯增加。脫氧核苷酸組處理后，各蛋白表達(dá)均有一定程度降低，見圖3。

2.4 組織病理學(xué)觀察 圖4、圖5可見，術(shù)后取腎縱切面行HE染色，顯示模型組纖維組織增生，腎小管萎縮，間質(zhì)性炎癥，上皮細(xì)胞呈空泡狀，脫氧核苷酸組雖然有部分增生，但較為輕微。正常組則無顯著改變。免疫組化檢測顯示模型組p-STAT1及p-STAT3蛋白表達(dá)顯著增加，脫氧核苷酸組有一定程度的增加，但是增加并不明顯，正常組則表達(dá)程度很低。

圖3 JAK2/STAT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

圖4 腎臟的HE染色(×400)

圖5 腎臟的免疫組化p-STAT1及p-STAT3表達(dá)(×400)

2.5 大鼠一般性指標(biāo) 術(shù)后大鼠體重增長較慢，顯著低于假手術(shù)組，脫氧核苷酸的干預(yù)有助于體重的增加。另外腎摘除術(shù)后尿蛋白，BUN，SCr水平均顯著增加，脫氧核苷酸的干預(yù)有利于降低尿蛋白，BUN，SCr水平，保護(hù)腎功能，見表2。

表2 三組大鼠一般性指標(biāo)比較(±s)

表2 三組大鼠一般性指標(biāo)比較(±s)

組別 體重(g)尿蛋白(mg/24 h)BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)446.6±14.2 6.2±2.4 6.51±0.7 37.35±6.38模型組 317.4±12.8 116.5±22.4 16.5±1.6 193.33±18.05脫氧核苷酸組假手術(shù)組366.5±23.8 42.5±21.4 12.6±1.4 121.74±10.3

3 討論

JAK2-STAT是凋亡、衰老的重要信號通路。研究顯示STAT的激活，可以激發(fā)下游途徑如casepase-3蛋白的活化，bcl-2/bax蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡〔8〕。另外JAK2-STAT亦是細(xì)胞衰老的重要途徑，有研究顯示人腎小球系膜細(xì)胞衰老過程中STAT1，STAT3均過度磷酸化〔9〕，尤其是Ang-Ⅱ的生成，可以進(jìn)一步導(dǎo)致JAK2-STAT信號通路的活化，促進(jìn)細(xì)胞的衰老，而采用Ang-Ⅱ受體抑制劑，則可以阻止STAT1，STAT3的磷酸化，細(xì)胞的衰老得到一定的控制〔10〕。脫氧核苷酸是細(xì)胞增殖和傳代所需要的遺傳底物，可以通過促進(jìn)細(xì)胞生長，增殖從而促進(jìn)損傷臟器的修復(fù)，可能有助于減少細(xì)胞的凋亡〔11〕。另外脫氧核苷酸具有穩(wěn)定細(xì)胞膜的功能，通過促進(jìn)細(xì)胞膜中蛋白質(zhì)的合成，維持細(xì)胞的正常形態(tài)，減緩衰老所造成的細(xì)胞萎縮〔12〕。因此我們猜想脫氧核苷酸對缺血、缺氧的腎臟細(xì)胞可能有較好的保護(hù)作用。但是其抗衰老、抗凋亡的機(jī)制，我們尚不明確。本研究提示脫氧核苷酸減少了腎小管上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的生長，采用Western印跡技術(shù)檢測相關(guān)蛋白顯示脫氧核苷酸促進(jìn)Bcl-2蛋白的合成、抑制Bax蛋白的表達(dá)，同時(shí)阻止STAT1，STAT3磷酸化活化。因此我們基本可以判斷脫氧核苷酸阻止了JAk2-STAT信號通路的表達(dá)。另外整體動物實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了我們的想法，給藥9 w后5/6腎切除大鼠體重有顯著改善，尿蛋白，BUN，Cr水平較模型組更低。HE染色也顯示，脫氧核苷酸具有一定的細(xì)胞修復(fù)作用，可以減少大鼠腎臟的纖維化病變，空泡性病變，減少炎癥。因此脫氧核苷酸對腎衰大鼠具有腎功能的保護(hù)作用。進(jìn)一步采用免疫組化檢測顯示脫氧核苷酸減少了P-STAT1，P-STAT3表達(dá)。因此本研究為脫氧核苷酸治療腎炎、腎功能衰竭提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是腎功能損傷的機(jī)制極其復(fù)雜，涉及的因素可能包括炎癥、氧化應(yīng)激、ECM過度沉積等，機(jī)制尚未完全闡明〔13〕，本研究，缺乏脫氧核苷酸對氧化應(yīng)激、炎癥因子表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究，尚不能確定其是否能清除腎衰大鼠體內(nèi)的氧自由基及炎癥性物質(zhì)，因此在臨床上脫氧核苷酸的效果尚不能估測，有待于更進(jìn)一步研究。

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