張敬 李貞 王婧嬌等

[摘要] 目的 研究口腔扁平苔蘚（OLP）患者外周血中維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt（RORγt）和4-1BB/4-1BBL mRNA的表達(dá)。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）法檢測30例OLP患者和30例健康人外周血中RORγt和4-1BB/4-1BBL的基因表達(dá)水平。結(jié)果 在OLP患者中，RORγt、4-1BB、4-1BBL mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），結(jié)果經(jīng)2-ΔΔCT轉(zhuǎn)換后，OLP組3種基因mRNA表達(dá)水平分別是健康對(duì)照組的3.087、3.320和4.005倍。RORγt和4-1BB mRNA的表達(dá)水平無明顯相關(guān)性（P>0.05），4-1BB和4-1BBL mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.455 0，P<0.05）。結(jié)論 RORγt和4-1BB/4-1BBL在OLP的發(fā)病中起了一定作用。

[關(guān)鍵詞] 維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt； 4-1BB； 4-1BBL； 口腔扁平苔蘚

[中圖分類號(hào)] Q 786 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.019

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是發(fā)生于口腔黏膜的慢性炎癥性疾病，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫異常是其重要的發(fā)病因素。研究結(jié)果顯示：Th17細(xì)胞在自身免疫性炎癥中處于重要地位[1-2]。維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt（retinoid-related orphan receptor γt，

RORγt）主要分布于CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞內(nèi)，作為

Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在Th17細(xì)胞分化發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[3]。共刺激分子4-1BB/4-

1BBL屬于腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體超家族成員，主要表達(dá)在活化的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）表面，其以受體配體相互作用的方式傳導(dǎo)信號(hào)，維持T細(xì)胞的活化狀態(tài)，延長其免疫應(yīng)答效應(yīng)[4]。本研究用實(shí)時(shí)熒光定量

聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitativepoly-merase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）方法檢測OLP患者和健康人外周血中RORγt及4-1BB/4-1BBL的表達(dá)，比較RORγt及4-1BB/4-1BBL mRNA在2組之間的表達(dá)差異和相關(guān)性，初步探索其與OLP的關(guān)系，為OLP尋找可能的致病機(jī)制，并為治療新策略的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 對(duì)照組 30例健康人外周血標(biāo)本為自愿者捐獻(xiàn)，其中男17例，女13例。年齡為24～46歲，均無全身及口腔黏膜疾病診斷，肝腎功能正常，排除感染等可能影響免疫狀態(tài)的情況。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，志愿者知情同意。

1.1.2 OLP組 30例OLP患者外周血標(biāo)本來自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科門診初次就診的OLP患者（均經(jīng)病理確診）[5]，其中男12例，女18例，年齡為28～72歲，均排除合并其他自身免疫性疾病，未接受任何激素和免疫抑制劑治療，排除感染等可能影響免疫狀態(tài)的情況。

1.2 主要試劑和儀器

全血RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、FQ-PCR試劑均由廣州達(dá)安生物技術(shù)有限公司合成。凝膠成像儀Gel Doc XR（BIO-RAD公司，美國），熒光定量

PCR儀（PRISM 7300，ABI公司，美國），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Z36HK，HERMLE公司，德國），DU800紫

外分光光度儀（Beckman公司，美國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 實(shí)驗(yàn)引物序列見表1。引物的設(shè)計(jì)經(jīng)查詢基因庫和通過Primer Premier 5.0軟件完成，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2 樣本處理 取外周靜脈血各2 mL，乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝

后，按全血提取試劑說明提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為：Oligo（dT）18引物1 μL，RNA模板5 μL（0.1 ng～5 μg），5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 4 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，DEPC水加至20 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），然后70 ℃

5 min（逆轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)），終止反應(yīng)。合成的

cDNA于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 FQ-PCR檢測 采用SYBR Green Ⅰ染料法，加樣過程中避光操作。反應(yīng)體系為：2×SYBR Green Mix 12.5 μL，上游引物F（10 μmol·L-1）0.5 μL，下游引物R（10 μmol·L-1）0.5 μL，cDNA 1 μL，ROX 0.05 μL，

dd水10.5 μL，總體積20 μL。

反應(yīng)條件為：將制備好的檢測樣本上機(jī)。本實(shí)驗(yàn)采用三步法：50 ℃預(yù)處理2 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)；然后95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；加收集熔解曲線反應(yīng)條件。每個(gè)標(biāo)本做2個(gè)復(fù)孔。擴(kuò)增結(jié)束后系統(tǒng)軟件自動(dòng)繪制擴(kuò)增曲線和熔解曲線。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 對(duì)RORγt、4-1BB、4-1BBL基因與內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)后，進(jìn)入結(jié)果分析界面。通過比較目的基因的CT值（CT值為每個(gè)

反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）與內(nèi)參照基因β-actin的CT值之差，即ΔCT來表示RORγt、4-1BB、4-1BBL基因與內(nèi)參基因β-actin的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算ΔΔCT，ΔΔCT=ΔCT（OLP組）-

ΔCT（對(duì)照組），目的基因在OLP組相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)差異倍數(shù)用2-ΔΔCT來表示，即是OLP患者與對(duì)照組相比，所檢測目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，F(xiàn)Q-PCR數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)以明確其是否正態(tài)性分布，2組間采用t檢驗(yàn)分析，相關(guān)分析采用Pearson直線相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總RNA質(zhì)量

紫外分光光度儀測定A260/A280，所有樣本比值為1.8～2.0，說明總RNA質(zhì)量較好。

2.2 RORγt、4-1BB和4-1BBL mRNA的表達(dá)

在30例健康人外周血和30例OLP患者外周血中，RORγt、4-1BB、4-1BBL基因均有表達(dá)，且在OLP組中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組（表2～4），以健康人外周

血中RORγt mRNA的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)，在此基礎(chǔ)上比較OLP組RORγt、4-1BB、4-1BBL基因的相對(duì)表達(dá)量。OLP組中RORγt、4-1BB、4-1BBL mRNA的表達(dá)量分別是對(duì)照組的3.087、3.320、4.005倍。

2.3 RORγt、4-1BB和4-1BBL基因表達(dá)水平的相關(guān)性

2.3.1 RORγt和4-1BB基因表達(dá)水平的相關(guān)性 對(duì)OLP組RORγt和4-1BB表達(dá)水平進(jìn)行直線相關(guān)分析，繪制兩者散點(diǎn)圖，可見散點(diǎn)分布雜亂，無明顯規(guī)律，

相關(guān)性分析結(jié)果表明2組數(shù)據(jù)關(guān)系不密切（r=0.332 2，

P>0.05）（圖1）。

3 討論

目前許多研究表明：OLP是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)性疾病。CD4+T淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在其發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[5]，根據(jù)產(chǎn)生細(xì)

胞因子和生物學(xué)功能的不同，將CD4+T淋巴細(xì)胞分為Th1、Th2及Tregs細(xì)胞亞群[6]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)了

一種新型的Th細(xì)胞亞群，不同于Th1、Th2及Tregs細(xì)胞，以分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17為主，被

命名為Th17細(xì)胞[7-8]，其在炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤和移植排斥等疾病中發(fā)揮了重要的作用?，F(xiàn)已證實(shí)RORγt是促進(jìn)Th17細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)其功能的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[9]。RORγt基因是RORC的一種剪接變異體，RORγt作為輔助性Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要分布于CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞內(nèi)。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將CD4+T細(xì)胞中的RORγt基因敲除后則不表達(dá)IL-17，而通過基因載體將RORγt過表達(dá)，則發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞不需要其他外來的細(xì)胞因子便可以表達(dá)IL-17。在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（experimentally allergic encephalomyelitis，EAE）小鼠模型中，RORγt缺陷的小鼠腸固有層IL-17表達(dá)明顯降低，且腸道易于感染，EAE發(fā)病延緩，病情減輕，由此證實(shí)了RORγt在Th17細(xì)胞分化中起關(guān)鍵性的作用[3]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示30例OLP患者和30例健康人外周血中均檢測到RORγt mRNA的陽性表達(dá)；OLP組RORγt mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P<0.05），表

達(dá)水平是對(duì)照組的3.087倍，顯示OLP患者RORγt基因表達(dá)相對(duì)于正常人上調(diào)。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性紫癜患者外周血中檢測到RORγt mRNA的表達(dá)量均較對(duì)照組顯著性增多。結(jié)果提示OLP患者RORγt上調(diào)導(dǎo)致T細(xì)胞趨向Th17分化增多，導(dǎo)致一系列炎癥及自身免疫性反應(yīng)。

研究[10]發(fā)現(xiàn)：4-1BB是腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成員，主要表達(dá)在活化的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞表面。4-1BBL相對(duì)分子質(zhì)量為34 000，屬腫瘤壞死因子（tu-

mor necrosis factor，TNF）超家族成員，其表達(dá)在B細(xì)胞和活化的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）、濾泡樹突狀細(xì)胞（follicle dendritic cell，F(xiàn)DC）上[11-12]。4-1BB/4-1BBL是在T細(xì)胞初次和再次應(yīng)答過程中一對(duì)重要的共刺激分子，其以受體配體相互作用的方式傳導(dǎo)信號(hào)，能有效刺激CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活化，分泌細(xì)胞因子及調(diào)節(jié)其增殖和存活，延長其免疫應(yīng)答效應(yīng)。4-1BB/4-1BBL在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性

脊柱炎等自身免疫性疾病外周血淋巴細(xì)胞上均有異常表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示30例OLP患者和30例健康人外周血中均檢測到4-1BB mRNA和4-1BBL mRNA陽性表達(dá)，且在OLP患者中的表達(dá)均明顯高于健康對(duì)照組（P<0.05），提示4-1BB、4-1BBL的異常表達(dá)參與了OLP的發(fā)病，OLP患者可能存在CD4+T細(xì)胞的活化、增殖和分化異常，這也可能是其參與免疫炎性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的原因之一。

本研究對(duì)OLP組RORγt和4-1BB表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示2組數(shù)據(jù)關(guān)系不密切，RORγt和4-1BB在OLP患者的表達(dá)無相關(guān)性（P>0.05），提示初始CD4+T細(xì)胞在第一信號(hào)和4-1BB/4-1BBL第二信號(hào)的共同作用下活化，在RORγt存在的的條件下，分化為Th17細(xì)胞，進(jìn)而執(zhí)行相應(yīng)的生物學(xué)功能。這是一個(gè)非常復(fù)雜而精細(xì)的過程，還需要應(yīng)用多種不同的方法或更進(jìn)一步深入的研究來探索其機(jī)制。對(duì)OLP組4-1BB、4-1BBL mRNA的表達(dá)水平作出相關(guān)分析，結(jié)果顯示4-1BB與4-1BBL表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05），

分析認(rèn)為當(dāng)機(jī)體受到外界免疫刺激后，引發(fā)了共刺激信號(hào)4-1BB/4-1BBL的異常激活，使兩者表達(dá)均增高，因此兩者呈正相關(guān)，這也提示這對(duì)共刺激分子表達(dá)水平的共同升高可能在OLP的發(fā)病中起一定的作用，但具體的機(jī)制還需要更深入的研究。

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（本文編輯 杜冰）