張金敏，鄭世華，仝巧云

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌 443003)

黃疸患者免疫力低下，易發(fā)生內(nèi)毒素血癥、腸黏膜屏障功能障礙、肝腎功能不全甚至多器官衰竭，病死率高［1～3］。內(nèi)毒素受體CD14是機(jī)體免疫反應(yīng)過程中的關(guān)鍵因素之一，能識別血中的內(nèi)毒素脂多糖(LPS)并與其結(jié)合，從而誘發(fā)免疫細(xì)胞的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，誘導(dǎo)IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子的表達(dá)，產(chǎn)生炎癥瀑布效應(yīng)［2］。2012年9月，我們建立了梗阻性黃疸(OJ)大鼠模型，觀察了其血清IL-6、TNF-α水平及肝臟Kuppfer 細(xì)胞CD14的表達(dá)變化，旨在探討黃疸性肝損傷的免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:清潔級雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量320～360 g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。主要試劑:大鼠IL-6 和TNF-α 酶聯(lián)免疫試劑盒為美國RapidBio 公司產(chǎn)品，兔抗大鼠CD14多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組及OJ 模型制作 將60 只大鼠隨機(jī)分為三組各20 只，其中黃疸組術(shù)前禁食12 h、禁水4 h，3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，取劍突下正中部切口，雙重結(jié)扎切斷膽管，制成OJ 模型;假手術(shù)組僅開腹分離膽管，但不結(jié)扎切斷;對照組不做特殊處理。

1.3 標(biāo)本采集 三組均于7 d 后以3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，以無菌注射器抽取下腔靜脈血1 mL 置于無菌EP 管中，同時取1 cm ×1 cm ×1 cm 大小肝臟組織以4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片。

1.4 血清IL-6 及TNF-α 水平測定 將下腔靜脈血低溫高速離心(3 000 r/min，4 ℃，10 min)，取血漿，采用ELISA 法測定血清IL-6 及TNF-α 質(zhì)量濃度。

1.5 肝臟Kuppfer 細(xì)胞CD14表達(dá)檢測 取上述肝臟組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟、脫水處理，以1∶200的兔抗大鼠CD14多克隆抗體為一抗，以HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體為二抗進(jìn)行免疫組化檢測，通過顯微圖像分析技術(shù)，測定CD14陽性反應(yīng)物(CD14為細(xì)胞膜著色，呈棕黃色，主要表現(xiàn)為肝竇邊緣及匯管區(qū)的星形細(xì)胞即Kuppfer 細(xì)胞陽性表達(dá))的平均積分光密度值(IOD/area)，其中IOD 為待測定區(qū)域陽性染色的積分光密度，area 為待測定區(qū)域的面積，每張切片隨即選取5個視野，取其平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s 表示，兩組間比較用成組t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清IL-6 及TNF-α 水平比較 與假手術(shù)組及對照組比較，黃疸組血清IL-6 及TNF-α 水平均顯著升高(P 均＜0.05)，前兩組比較無顯著差異(P＞0.05)。詳見表1。

2.2 三組肝臟Kuppfer 細(xì)胞CD14表達(dá)比較 黃疸組、假手術(shù)組及對照組肝臟Kuppfer 細(xì)胞CD14表達(dá)的IOD/area 依次為0.016 5±0.001 9、0.001 2±0.000 7、0.001 2±0.000 8，黃疸組顯著強(qiáng)于后兩組，P 均＜0.01。詳見圖1。

表1 三組血清IL-6 及TNF-α 水平比較(pg/mL，±s)

表1 三組血清IL-6 及TNF-α 水平比較(pg/mL，±s)

圖1 三組肝臟Kuppfer 細(xì)胞CD14表達(dá)情況

3 討論

黃疸是膽道疾病最常見的臨床表現(xiàn)之一，是指各種原因致肝內(nèi)膽管、肝總管、膽總管等部分或全部阻塞，膽汁無法引流進(jìn)入腸道而出現(xiàn)的臨床癥狀。黃疸患者因易發(fā)生各種感染、胃腸道出血甚至多器官衰竭而具有較高的病死率。研究［1，3，4］表明，內(nèi)毒素血癥是造成黃疸患者免疫功能損傷的主要因素，黃疸時腸黏膜屏障的解剖結(jié)構(gòu)和功能完整性遭到破壞，易發(fā)生腸源性細(xì)菌移位;更重要的是此時肝臟Kuppfer 細(xì)胞的免疫功能受到抑制，清除內(nèi)毒素的能力下降，從而容易導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥形成［5］。在LPS刺激下，Kuppfer 細(xì)胞發(fā)生一系列級聯(lián)反應(yīng)，引起機(jī)體損傷;加之炎癥細(xì)胞因子過量產(chǎn)生，從而使機(jī)體免疫功能受損［4，6］。

IL-6 和TNF-α 是機(jī)體重要的炎性細(xì)胞因子，主要由激活的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生，由于肝臟Kuppfer 細(xì)胞占網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的90%左右，血清IL-6 和TNF-α 水平一定程度上也可反映Kuppfer 細(xì)胞受刺激的狀態(tài)［7］。內(nèi)毒素受體CD14是機(jī)體免疫反應(yīng)過程中的關(guān)鍵因素之一。在肝臟CD14主要表達(dá)于Kupffer 細(xì)胞，肝細(xì)胞也有少量表達(dá)。CD14可識別血中的LPS 并與其結(jié)合引發(fā)免疫細(xì)胞的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，激活NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而誘導(dǎo)眾多炎癥相關(guān)特異基因表達(dá)TNF-α、IL-6 等炎性細(xì)胞因子［3］。本研究顯示，與假手術(shù)組及對照組比較，黃疸組血清IL-6 及TNF-α 均顯著升高，前兩組比較無顯著差異?？赡軝C(jī)制:OJ 形成可促發(fā)細(xì)胞因子的級聯(lián)反應(yīng)，形成所謂的“瀑布效應(yīng)”;而異常升高的IL-6 和TNF-α 可與其他炎性細(xì)胞因子協(xié)同激活肝臟內(nèi)的磷脂酶，分解磷脂為花生四烯酸，產(chǎn)生對肝細(xì)胞有毒性作用的白三烯和超氧自由基，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。

Kupffer 細(xì)胞是肝臟表達(dá)CD14的主要細(xì)胞，因而大鼠肝臟組織CD14的表達(dá)變化能反映Kupffer細(xì)胞CD14表達(dá)情況。國外學(xué)者的研究［8，9］顯示，OJ 時肝臟Kuppfer 細(xì)胞數(shù)量增多，且CD14表達(dá)增強(qiáng)，對內(nèi)毒素刺激敏感性增強(qiáng)，可能通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)產(chǎn)生和釋放包括IL-6、TNF-α 在內(nèi)的大量細(xì)胞因子。Miyaso 等［10］報道，黃疸時Kupffer 細(xì)胞CD14表達(dá)明顯增強(qiáng)，并認(rèn)為高表達(dá)的CD14與內(nèi)毒素的刺激作用有關(guān)。LPS 既是CD14的配體又是CD14表達(dá)的激活因素，體內(nèi)實驗及體外研究均表明LPS 可上調(diào)Kupffer 細(xì)胞CD14的表達(dá)。資料［11～13］表明，黃疸患者存在著明顯的內(nèi)毒素血癥，原因主要有兩點:①腸道內(nèi)毒素吸收增加。一方面，由于膽汁不能排入腸道，失去了膽鹽對細(xì)菌繁殖的抑制作用，腸道菌群失調(diào)，細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素增加。另一方面，腸黏膜屏障功能破壞，腸道通透性增加，內(nèi)毒素經(jīng)腸壁吸收入血增多。②內(nèi)毒素清除障礙。OJ 時網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)Kupffer 細(xì)胞功能降低，大量入血的內(nèi)毒素不能有效吞噬和降解，致使內(nèi)毒素溢入體循環(huán)。因此，黃疸大鼠Kupffer細(xì)胞CD14表達(dá)增高是內(nèi)毒素持續(xù)刺激的結(jié)果。本研究顯示，黃疸組肝臟Kuppfer 細(xì)胞CD14表達(dá)顯著強(qiáng)于假手術(shù)組和對照組，后兩組無顯著差異。提示OJ 大鼠Kupffer 細(xì)胞被激活，并介導(dǎo)了對內(nèi)毒素的免疫及炎癥反應(yīng);OJ 時大鼠Kupffer細(xì)胞CD14表達(dá)增高是內(nèi)毒素持續(xù)刺激所導(dǎo)致，其引起炎癥介質(zhì)血清IL-6、TNF-α 等高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟免疫功能受損、引發(fā)全身炎癥反應(yīng)。

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