鄧 黎，韓 濤，王曉虹，皮 立，韓 發(fā)

中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810008

蛹蟲(chóng)草［C.militarisc(L).Link］又名北冬蟲(chóng)夏草。屬子囊菌亞門、核菌綱、球殼目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬，世界上已發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)草屬真菌350多種，我國(guó)記錄61種［1］。蛹蟲(chóng)草含有蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸(甘露醇)、蟲(chóng)草多糖、維生素、蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶、多種微量元素等化學(xué)成分［2-4］。

蟲(chóng)草酸即甘露醇，又稱 D-甘露糖醇，分子式C6H14O6，分子量182.17，是蟲(chóng)草的重要活性成分之一［5］。隨著對(duì)蟲(chóng)草酸作用機(jī)理的認(rèn)識(shí)不斷深入，其臨床用途越來(lái)越廣泛，蟲(chóng)草酸已經(jīng)應(yīng)用于治療顱內(nèi)疾病、頑固心絞痛、消化系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、泌尿系統(tǒng)疾病、眼科疾病、頑固性超高熱以及中毒時(shí)導(dǎo)瀉等［6，7］。由于甘露醇的化學(xué)穩(wěn)定性好，具甜味又不吸濕性，廣泛用于抗癌藥及維生素藥片的賦形劑，也用于醒酒藥和清涼劑等配方［8］，顯示了蟲(chóng)草酸在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間。從蛹蟲(chóng)草中直接分離提取得到蟲(chóng)草酸并進(jìn)一步應(yīng)用于藥劑、保健品等可為蛹蟲(chóng)草在有效活性成分方面的應(yīng)用提供更廣泛的空間，保證蟲(chóng)草酸來(lái)源的優(yōu)質(zhì)和可靠性。

近年來(lái)，研究人員對(duì)蟲(chóng)草酸的提取進(jìn)行了工藝改進(jìn)和優(yōu)化，但是所得到的優(yōu)化工藝均是在單因素或正交試驗(yàn)條件下獲得的。響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，可檢查一個(gè)或多個(gè)響應(yīng)變量與一系列試驗(yàn)變量之間的關(guān)系，確定試驗(yàn)因素及其交互作用在工藝過(guò)程中對(duì)指標(biāo)響應(yīng)值的影響，精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系［9］。因此，將響應(yīng)面分析的方法應(yīng)用于人工培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草酸微波提取工藝的研究，建立得率與考察因素之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)是有必要的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司;KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;METTLER TOLEDO PL203和XS204電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司;P 70 D 17 TLD5微波爐，格蘭仕微波爐電器有限公司;電熱恒溫水浴鍋，布氏抽濾漏斗，Lary 300紫外分光光度儀(美國(guó));DHG-9070 A型電熱恒溫故風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

人工培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草CSM-8菌株由西寧世峰生物科技有限公司提供。樣品經(jīng)微波干燥后，粉碎、過(guò)60目篩，加入無(wú)水乙醇脫脂。甘露醇對(duì)照品由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提供。實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草酸分析測(cè)定方法

1.2.1 蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草酸的提取及測(cè)定

用天平準(zhǔn)確稱取干燥后的子實(shí)體粉末1.00 g，加入適量的超純水后超聲提取、離心、抽濾，濃縮后定容至10 mL，靜置，得到待測(cè)液。

比色法測(cè)定蟲(chóng)草酸含量。取待測(cè)溶液1.00 mL加入1.00 mL高碘酸鉀溶液混勻，室溫放置10 min，加2.00 mL 0.1%L-鼠李糖溶液以除去過(guò)多的高碘酸鉀，混勻后加4 mL新鮮配制的NaSh試劑(150 g醋酸銨+2.00 mL冰醋酸+2.00 mL乙酰丙酮，用蒸餾水稀釋至1000 mL)，53℃水浴加熱15 min使其呈色，冷卻，在分光光度儀415 nm處，以蒸餾水作空白對(duì)照，測(cè)定吸光度值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線:精確稱取干燥至恒重的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，加蒸餾水50 mL配制成濃度1 mg/mL的蟲(chóng)草酸溶液，依次稀釋，得系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按蟲(chóng)草酸含量測(cè)定方法操作，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，得Y=0.008X+0.0203，R2=0.9995，表明甘露醇在 10 ～ 50 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性。

1.2.2 蟲(chóng)草酸含量和提取率計(jì)算

蟲(chóng)草酸含量(%) = (被測(cè)液中蟲(chóng)草酸的濃度×待測(cè)液總體積) ÷稱取的子實(shí)體質(zhì)量

蟲(chóng)草酸提取率(%) = 被測(cè)液中蟲(chóng)草酸含量÷子實(shí)體樣品中蟲(chóng)草酸含量(已有試驗(yàn)中測(cè)定得到微波干燥方法下子實(shí)體中的蟲(chóng)草酸含量為6.74%)

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

主要考察微波時(shí)間、微波功率、液料比以及提取次數(shù)對(duì)人工蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草酸提取率的影響。按照1.2.1方法提取蟲(chóng)草酸，并計(jì)算提取率。

1.3.1.1 微波時(shí)間對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響

按提取基本條件，分別考察 2、3、4、5、6 min 對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響。

1.3.1.2 微波功率對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響

按提取基本條件，分別考察微波為200、400、500、600、700 W對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響。

1.3.1.3 液固比對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響

按提取基本條件，分別考察液固比20、30、40、50和60 mL/g對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響。

1.3.1.4 提取次數(shù)對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響

按提取基本條件，分別考察提取次數(shù)為1、2、3次對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響。

1.3.2 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)響應(yīng)值(蟲(chóng)草酸提取率)有顯著影響的因素，利用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。每一變量的低、中、高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，模型選用二次方程Y=β0+β1x1+β2x2+β3x3+β12x1x2+β13x1x3+β23x2x3+。

其中 Y 為響應(yīng)值(蟲(chóng)草素提取率)，β0、β1、β2、β3、β12、β13、β23、β11、β22、β33為方程系數(shù)，x1、x2、x3為自變量編碼值。通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析來(lái)進(jìn)一步考察提取時(shí)間、微波功率和液固比之間的相互影響，并確定微波法提取蟲(chóng)草酸的最佳工藝參數(shù)。

1.3.3 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按照響應(yīng)曲面法確定的最佳提取工藝參數(shù)，對(duì)100 g CSM-8菌株子實(shí)體粉末進(jìn)行微波提取，取500 mL提取液濃縮成濃膏狀，烘干，測(cè)定提取液中固形物和蟲(chóng)草酸的含量，并計(jì)算蟲(chóng)草酸的提取率。測(cè)定結(jié)束后將固形物重新用蒸餾水溶解并定容到500 mL，放回到提取液中。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響

由圖1見(jiàn)，在2～4 min內(nèi)，蟲(chóng)草酸提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)提高比較明顯，4 min后開(kāi)始下降。因此設(shè)定提取時(shí)間為3～5 min。

圖1 提取時(shí)間對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響Fig.1 Effect of extraction duration on cordyceps acid yield

2.1.2 微波功率對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響

由圖2見(jiàn)，在微波時(shí)間4 min內(nèi)，隨著功率的增加，蛹蟲(chóng)草多糖的提取率逐漸升高，在功率達(dá)到500 W之后，蟲(chóng)草酸的提取率變化不大，表明基本提取完全。因此設(shè)定微波功率為400～600 W。

圖2 微波功率對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響Fig.2 Effect of microwave power on cordyceps acid yield

2.1.3 液固比對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響

從圖3見(jiàn)，隨液固比的增大，蟲(chóng)草多糖的提取率不斷升高，在液固比為20～40 mL/g時(shí)迅速升高，在50 mL/g時(shí)達(dá)到最大值，在50 mL/g以后提取率無(wú)明顯增加，呈穩(wěn)定趨勢(shì)。因此，微波輔助提取法提取蟲(chóng)草多糖的液固比確定為30～50 mL/g。

圖3 液固比對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to liquid on cordyceps acid yield

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響

在液固比50 mL/g、微波功率500 W、提取時(shí)間4 min的條件下，考察提取次數(shù)對(duì)蟲(chóng)草多糖提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，第一次提取率為35.92%，第二次提取后累計(jì)達(dá)48.00%(相對(duì)一次提取的結(jié)果增加比較顯著)，提取3次累計(jì)的提取率為48.01%，與提取2次的提取率間無(wú)差異。結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本核算考慮以提取2次為宜。

圖4 提取次數(shù)對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響Fig.4 Effect of times of extraction on cordyceps acid yield

2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)曲面法分析因素的選取及分析方案

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上固定提取次數(shù)為3次，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，分別以微波功率、提取時(shí)間和液固比對(duì)應(yīng)3個(gè)獨(dú)立變量X1、X2、X3，并以-1、0、1分別代表變量的水平。

對(duì)自變量進(jìn)行編碼(表1)。式中xi為變量的編碼值，Xi為變量的真實(shí)值，X0為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)變量的真實(shí)值，ΔX為單變量增量，蟲(chóng)草酸提取率Y為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表1和2。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及蟲(chóng)草酸提取率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到回歸方程為:

對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3得出:模型的P＜0.0001，表明模型極顯著且失擬項(xiàng)不顯著(P=0.3125＞0.05)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9962，說(shuō)明模型擬合程度很好。模型的調(diào)整確定系數(shù)AdjR2=0.9914，說(shuō)明該模型能解釋99.14%的響應(yīng)值的變化，可以用此模型對(duì)微波提取CSM-8菌株子實(shí)體中蟲(chóng)草酸提取率進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。

模型回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗(yàn)如下:一次項(xiàng)A(P ＜0.0001)、B(P ＜0.0001)，二次項(xiàng) A2(P ＜0.0001)、B2(P ＜0.0001)、C2(P ＜0.0001)均達(dá)到極顯著水平，一次項(xiàng)C(P=0.0014 ＜0.01)達(dá)到顯著水平，表明微波功率、提取時(shí)間、液固比對(duì)蟲(chóng)草酸提取率有顯著影響;二次項(xiàng) AB(P=0.0052＜0.01)、AC(P=0.0011 ＜0.01)、BC(P=0.0003＜0.001)，表明微波功率與提取時(shí)間、微波功率與液固比以及提取時(shí)間與液固比的交互作用對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響顯著。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Levels and codes of variable chose for Box-Behnken design

利用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見(jiàn)圖5、6和7。

由圖5可看出，提取時(shí)間和微波功率的交互作用對(duì)蟲(chóng)草酸提取的影響較顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，響應(yīng)值隨微波功率的變化率大于隨提取時(shí)間的變化率，說(shuō)明微波功率對(duì)提取率的影響大于提取時(shí)間;液固比固定時(shí)，蟲(chóng)草酸提取率隨微波功率的增大而升高，當(dāng)微波功率達(dá)到550 W后，提取率增長(zhǎng)緩慢并趨于平緩;蟲(chóng)草酸提取率水提取時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，呈拋物線趨勢(shì)。由圖6可看出，微波功率和液固比的交互作用對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響較顯著;響應(yīng)值隨微波功率的變化率大于液固比，說(shuō)明微波功率對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響大于液固比;蟲(chóng)草酸提取率隨液固比的增長(zhǎng)而緩慢增長(zhǎng)，當(dāng)液固比為40～50 mL/g時(shí)，蟲(chóng)草酸提取率基本沒(méi)有變化。由圖7可看出，液固比和提取時(shí)間的交互作用對(duì)蟲(chóng)草提取率的影響極顯著，表現(xiàn)為曲面較陡;響應(yīng)值隨提取時(shí)間的變化率大于液固比，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)蟲(chóng)草酸提取率的影響大于液固比;蟲(chóng)草酸提取率隨液固比和提取時(shí)間的增大而增大，并慢慢趨于平緩。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及蟲(chóng)草酸提取率的測(cè)定值Table 2 Box-Behnken design and the responses of the total cordyceps acid yield

表3 回歸模型的方差分析Table 3 ANOVA analysis for response surface quadratic model

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001，-P ＞0.05

利用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行進(jìn)一步的典型性分析，得到最優(yōu)提取工藝條件為:微波功率555 W，液固比35 mL/g，提取時(shí)間4 min，提取2次，蟲(chóng)草酸提取率的理論值可達(dá)84.45%。

圖5 微波功率和提取時(shí)間影響蟲(chóng)草酸提取率的等值線與響應(yīng)面Fig.5 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X1:microwave power;X2:extraction duration)on the response Y

圖6 微波功率和液固比影響蟲(chóng)草酸提取率的等值線與響應(yīng)面Fig.6 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X1:microwave power;X3:solventmaterial ratio)on the response Y

圖7 提取時(shí)間和液固比影響蟲(chóng)草酸提取率的等值線與響應(yīng)面Fig.7 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X2:extraction duration;X3:solvent-material ratio)on the response Y

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

最優(yōu)工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值為85.77%，略高于預(yù)測(cè)值，RSD=0.67%，表明二次多項(xiàng)式建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，所選工藝條件重現(xiàn)性好。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 4 Verification of optimal extraction conditions for the total cordycepic acid yield

3 結(jié)論

本研究根據(jù)中心組合(Box-Benhnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，應(yīng)用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化提取時(shí)間、微波功率和液固比對(duì)人工培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草酸微波提取的工藝條件。結(jié)果表明，微波提取人工培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草酸的最佳工藝條件為微波功率555 W，液固比35 mL/g，提取時(shí)間4 min，提取2次，蟲(chóng)草酸提取率的理論值可達(dá)84.45%。

1 Liang ZQ(梁宗琦).A corroboration of the anamorph of Cordyceps militaris-Paecilomyces militaris Liang sp.nov..Acta Edulis Fungi(食用菌學(xué)報(bào))，2001，8(4):28-32.

2 Wang JF(王建芳)，Yang CQ(楊春清).Summary on effective constituent and pharmacological action of Cordyceps cicadae.Inf Tradit Chin Med(中醫(yī)藥信息)，2005，22(5):30-32.

3 Zhang ZJ(張志軍).Study on new type effective ingredients of cultured Cordyceps militaris SY-(12).Qingdao:Ocean U-niversity of China(中國(guó)海洋大學(xué))，MSc.2007.

4 Cai YH(蔡友華)，F(xiàn)an WX(范文霞)，Liu XM(劉學(xué)銘)，et al.Determination of cordycepic acid content in the mycelia of Cordyceps brasiliensis Henn by colorimetry.Mod Food Sci Technol(現(xiàn)代食品科技)，2008，25:76-79.

5 Zhu MW(朱明偉)，Wen L(溫魯)，Wei P(魏鵬)，et al.Effect of different liquid culture media on the contents of polysaccharide and cordycepic acid in Cordyceps militaris.J Anhui Agric Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2008，36:573-574，596.

6 Gu ZY(顧振宇)，Wu XM(吳雪美)，Zhang H(張虹).Determination of cordycepin and cordycep acid in Cordyceps sinensis by high-performance liquid chromatography.J Chin Inst Food Sci Technol(中國(guó)食品學(xué)報(bào))，2007，7:144-148.

7 Lei BX(雷幫星)，Gao HB(高海波)，Shui XB(稅小波)，et al.Determination of mannitol in fermented myceliaof Cordyceps gummii.J Fungal Res(菌物研究)，2004，2:40-44.

8 Sun CX(孫成秀)，Liao JL(廖記錄)，Long XH(龍小慧)，et al.New clinical uses of mannitol.New Med(新醫(yī)學(xué))，1996，27:41-42.

9 Wang YF(王永菲)，Wang CG(王成國(guó)).The application of response surface methodology.J Minzu Univ China，Nat Sci Edn(中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2005，14:236-240.