李喜兵，陳秋霞，張堅(jiān)松

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410006）

近年來由于大氣污染加重，慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支氣管哮喘（哮喘）、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化等慢性炎癥性氣道疾病在疾病譜中的比重逐漸增高，已經(jīng)成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。慢性炎癥性氣道疾病發(fā)病時往往會發(fā)生AHR，表現(xiàn)為氣道對正常不引起或僅引起輕度應(yīng)答反應(yīng)的非抗原性刺激物出現(xiàn)過度的氣道收縮反應(yīng)。支氣管哮喘是導(dǎo)致AHR 最常見的疾病，哮喘以外的其他呼吸道疾病也可以呈現(xiàn)氣道高反應(yīng)性[1]。

本實(shí)驗(yàn)從氣道失穩(wěn)態(tài)機(jī)制出發(fā)，采用O3應(yīng)激大鼠，建立變異性AHR 大鼠模型，根據(jù)O3應(yīng)激下EOS、IgE、IL-13、IFN-γ 等參數(shù)的變化初步探討臭氧應(yīng)激引發(fā)AHR的機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康SPF 級SD 大鼠20 只，全部為雄性，體重為150±10g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑

大鼠IFN-γ 檢測試劑盒（ADL），IL-13 檢測試劑盒（ADL），淋巴細(xì)胞分離液（Sigma），RPMI1640培養(yǎng)基（Sigma），生物素化的小鼠抗大鼠IgE 單克隆抗體（Sigma），氯化乙酰膽堿（Ach,Sigma），其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器

動物呼吸機(jī)（北京鑫奧成科技有限公司），臭氧發(fā)生器（石家莊市藍(lán)電科技開發(fā)有限公司），圖像采集系統(tǒng)（美國Motic 公司），酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thenmo 公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物分組

20 只SD 大鼠隨機(jī)分為2組：正常對照組，O3應(yīng)激組，每組10 只，分籠飼養(yǎng)在清潔、安靜、溫濕度穩(wěn)定的環(huán)境中，給予充足的飼料和飲水，避免接觸其他有害致敏源。正常對照組不做特殊處理。O3應(yīng)激組大鼠每天上午定時吸入2.0ppm 臭氧與新鮮空氣混合氣1h，觀察并記錄O3應(yīng)激期間實(shí)驗(yàn)大鼠的各項(xiàng)生理反應(yīng)。兩組共計(jì)飼養(yǎng)4d。

1.5 氣道反應(yīng)性測定

正常對照組和O3應(yīng)激組飼養(yǎng)第4d 后間隔24h，參照文獻(xiàn)[2]介紹方法分別測定各組實(shí)驗(yàn)動物的氣道反應(yīng)性。稱重后按4mL/kg的劑量腹腔注射25%烏拉坦，麻醉實(shí)驗(yàn)動物，仰面平臥固定大鼠，消毒后分離出頸靜脈和氣管，用靜脈留置針行頸靜脈穿刺并固定，于第3、4 環(huán)狀軟骨間以V 形剪開氣管，行氣管插管，接動物呼吸機(jī)，呼吸頻率為75 次/min，吸呼比為1：1，潮氣量為8mL/kg，待實(shí)驗(yàn)大鼠呼吸基本平穩(wěn)后通過頸靜脈先后間歇推注生理鹽水0.5mL 以 及10～160μg/kg 濃 度 梯 度的Ach 0.5mL，每次間隔大約3min，用動物肺功能分析軟件檢測基礎(chǔ)和用藥后的Re，當(dāng)Re 超過基礎(chǔ)值的2倍以上時，就可以停止Ach 推注，通過Re的變化來代表氣道反應(yīng)性的改變[3]。

1.6 血漿IgE 水平檢測

測定完氣道反應(yīng)性后，以股動脈放血的方式處死實(shí)驗(yàn)大鼠，消毒胸腔部皮膚，在前正中線沿胸骨柄自下而上打開胸腔，無菌條件下從心臟穿刺采血2mL，放入肝素抗凝管，離心后吸取血漿100μL，以酶聯(lián)免疫吸附-雙抗夾心法測定血漿IgE 水平，450nm 波長下以全自動酶標(biāo)儀測定OD 值，以各自O(shè)D 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類

氣管插管緩緩插入左肺，固定好后用37℃無菌生理鹽水3mL 緩慢注入左肺內(nèi)，輕輕按摩膨大的左肺，然后緩慢回抽BALF，再將所得液體重新緩慢注入左肺內(nèi)，反復(fù)3 次，最后一次注入后回收BALF，置于冰浴保存的離心管中。然后重復(fù)4 次上述操作。準(zhǔn)確計(jì)量回收的BALF 體積，在4℃下以1500r/min 離心20min，上清液-20℃冷凍保存用于檢測總蛋白水平。細(xì)胞沉淀用溶紅細(xì)胞液懸浮，4℃下以1500r/min 離心10min，棄上清，再次用生理鹽水懸浮細(xì)胞沉淀，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸浮液涂片后進(jìn)行Wright-Giemsa 染色，鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)并分類。

1.8 支氣管肺泡灌洗液總蛋白水平測量

冷凍保存的支氣管肺泡灌洗液解凍后作為待測樣品，加入考馬斯亮藍(lán)G-250 試劑5mL，靜置5min 后，在可見光分光光度計(jì)上比色，測定波長為595nm，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品蛋白質(zhì)含量[4]，每個待測樣品均進(jìn)行3 次重復(fù)測量，取其平均值作為此實(shí)驗(yàn)大鼠BALF的總蛋白含量。

1.9 肺組織病理變化

在無菌條件下取部分未經(jīng)肺泡灌洗的肺組織，按以下順序進(jìn)行病理切片染色：4%多聚甲醛溶液固定24h，梯度乙醇常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，厚度為4μm。脫蠟后在室溫下常規(guī)HE 染色，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.10 PBMC 制備培養(yǎng)及培養(yǎng)上清IL-13、IFN-γ水平測定

取100μL 血漿測定IgE 后剩余部分以等量Hank's 液稀釋，離心管中加入淋巴細(xì)胞分層液后，小心沿著管壁加入稀釋血清，2000r/min 密度梯度離心20min，用毛細(xì)吸管小心吸出分層液上方呈現(xiàn)白膜狀的PBMC，經(jīng)多次洗滌懸浮后用含10%小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度到1×106/mL，置37℃、5%CO2孵箱飽和濕度條件下培養(yǎng)48h，以1000r/min 離心15 分鐘收集上清液，以酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-13。加入終止反應(yīng)液后的30 分鐘內(nèi)在全自動酶標(biāo)儀上以450nm 波長讀取各孔的OD值。以各自O(shè)D 值作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行兩樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 判定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氣道反應(yīng)性改變

兩組實(shí)驗(yàn)大鼠的基礎(chǔ)Re 差別不大，給與生理鹽水激發(fā)后的Re 也相差不大，都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；而給與10～40μg/kg 梯度的Ach 激發(fā)后，O3應(yīng)激組Re 與正常對照組比較O3應(yīng)激組Re 普遍升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；給與80～160μg/kg梯度的Ach 激發(fā)后，O3應(yīng)激組Re 與正常對照組比較存在顯著差別(P＜0.01)，O3應(yīng)激組Re 明顯升高。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠Re的比較(n=10)

2.2 肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類，總蛋白含量改變

2.2.1 肺泡灌洗液中總蛋白含量變化

O3應(yīng)激組與正常對照組比較，O3應(yīng)激組肺泡灌洗液中總蛋白含量明顯增加（P＜0.01），結(jié)果見表2。

表2 BALF中總蛋白含量的比較（n=10）

2.2.2 肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)的變化

O3應(yīng)激組與正常對照組比較，O3應(yīng)激組肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)明顯增加（P＜0.01）。光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)200 個細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞分類。O3應(yīng)激組和正常對照組比較：淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞均可見O3應(yīng)激組明顯高于正常對照組（P＜0.01）；嗜堿性粒細(xì)胞升高不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 各組肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類

2.3 肺組織病理變化

正常對照組肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，肺泡形態(tài)大小正常，未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。細(xì)支氣管壁形狀規(guī)則，管腔無狹窄；O3應(yīng)激組肺間質(zhì)明顯增生，正常形態(tài)肺泡減少，常見到多個肺泡融合成肺大泡現(xiàn)象，炎性細(xì)胞浸潤明顯。HE 染色鏡下結(jié)果見圖1。

圖1 各組肺組織石蠟切片HE 染色（HE×400）

正常對照組：肺泡形態(tài)大小正常，肺間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤及粘液滲出，細(xì)支氣管管壁形態(tài)規(guī)則，管腔無狹窄；O3應(yīng)激組：肺間質(zhì)明顯增生，正常形態(tài)肺泡減少，常見到多個肺泡融合成肺大泡現(xiàn)象，炎性細(xì)胞浸潤明顯。

2.4 PBMC 培養(yǎng)上清中IL-13、IFN-γ 及血漿IgE抗體水平變化

O3應(yīng)激組與正常對照組比較O3應(yīng)激組IL-13、IFN-γ 及血漿Ig E 水平均明顯增加（P＜0.01），結(jié)果見表4。

表4 PBMC 培養(yǎng)上清IL-13、IFN-γ 及血漿Ig E 水平的比較（n=10）

3 討論

AHR 相關(guān)疾病的病因復(fù)雜，直接進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)困難很大，因此動物實(shí)驗(yàn)成為了研究相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制、查找病因、對治療方法和治療藥物進(jìn)行評價等方面的首選。然而動物模型品種繁多，使用AHR 動物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的選擇相對應(yīng)的動物模型，使其盡量接近人類疾病。SD大鼠具有品系純、繁殖快、價格低、來源廣、標(biāo)本收集量大等特點(diǎn)，而且人的生物學(xué)特點(diǎn)與其有很多的相似性[5]，所以SD 大鼠成為了本研究建立AHR 動物模型的首選。

傳統(tǒng)的AHR 大鼠模型的建立一般是采取OVA 致敏建立哮喘大鼠模型的方法[6]，這種方法存在建模周期長的缺點(diǎn)，而且一般更多的是針對哮喘而言的，在AHR 方面的研究，氣道粘膜本身的防護(hù)作用容易被人所忽視[7]。有研究表明AHR 疾病是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。氣道高反應(yīng)性和氣道慢性炎癥是支氣管哮喘重要的病理生理學(xué)特點(diǎn)[8]。呼吸道上皮細(xì)胞代謝和分泌功能都很活躍，能夠和周邊的組織細(xì)胞實(shí)現(xiàn)相互的細(xì)胞間信息傳遞；一方面可以調(diào)節(jié)周邊組織細(xì)胞及局部微環(huán)境，同時也可以因局部微環(huán)境的各種信號改變而發(fā)生適應(yīng)性改變[9-10]。有理由認(rèn)為：呼吸道上皮的結(jié)構(gòu)破壞及功能失調(diào)，有可能是AHR的原發(fā)原因。

本研究建立的模型采用O3應(yīng)激大鼠，同正常對照組大鼠模型進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，氣道反應(yīng)性，BLAF中細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類，血漿IgE 水平等各項(xiàng)指標(biāo)均升高；肺組織病理切片顯示肺間質(zhì)明顯增生，正常形態(tài)肺泡減少，常見到多個肺泡融合成肺大泡現(xiàn)象，炎性細(xì)胞浸潤明顯。以上指標(biāo)均證實(shí)了AHR的存在，建模成功。通過O3應(yīng)激建立AHR 模型，時間短，成本低，操作簡單可靠，相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑多，參考價值高，為AHR 疾病的研究提供了新的思路。

有文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道大多數(shù)傳統(tǒng)的通過OVA 致敏建造的AHR 大鼠模型會有呼吸急促；呼吸節(jié)律不規(guī)則；口唇發(fā)紺；行動遲緩；四肢癱瘓；大小便失禁等表現(xiàn)，單純以這樣主觀認(rèn)知的生理現(xiàn)象來判斷造模是否成功不太可取，沒有反應(yīng)AHR的實(shí)質(zhì)性數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過臭氧應(yīng)激建造的AHR 大鼠模型有呼吸加快、煩躁不安、立毛等癥狀，但上述報(bào)道的其它癥狀很少出現(xiàn)，同既往報(bào)道比較存在差異。

傳統(tǒng)OVA 致敏引發(fā)哮喘的研究認(rèn)為：體液免疫途徑是引發(fā)AHR 發(fā)生的關(guān)鍵原因。在哮喘發(fā)生前CD4+T 細(xì)胞可分化為Thl和Th2 類細(xì)胞且保持平衡，隨著哮喘的發(fā)生發(fā)展，Th1/Th2的平衡會被打破，Th2 細(xì)胞會逐漸占據(jù)主要地位，細(xì)胞功能亢進(jìn)，釋放Th2 類細(xì)胞因子，引起體液免疫的發(fā)生。但也有研究發(fā)表了不同的觀點(diǎn)：如RomyFischer 等人在2007年發(fā)表文章指出IFN-γ/IL-18和IFN-γ 誘導(dǎo)蛋白參與了過敏性哮喘的發(fā)病，而誘導(dǎo)Thl 類免疫反應(yīng)的IL-12 可能促進(jìn)而非抑制IgE的生成及Th2類免疫反應(yīng)，所以他們認(rèn)為，Thl 類和Th2 類細(xì)胞因子可能同時參與了嗜酸粒細(xì)胞炎癥及噬中性粒細(xì)胞炎癥的產(chǎn)生[13]。IFN-γ 是Th l 類細(xì)胞典型的細(xì)胞因子，本實(shí)驗(yàn)O3應(yīng)激組大鼠IFN-γ 較正常對照組明顯升高，提示Th1 類細(xì)胞因子參與了AHR 發(fā)生的相關(guān)病理過程，激活和促進(jìn)了細(xì)胞免疫途徑；IL-13 是一類由Th2 類細(xì)胞產(chǎn)生的能廣泛參與抗原提呈及炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子，可促進(jìn)B 細(xì)胞成熟和分化，從而釋放出針對特異致敏原的IgE，促進(jìn)體液免疫途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，O3應(yīng)激組大鼠IL -13和血清IgE 均較正常對照組明顯升高，提示了Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，大量釋放Th2 類細(xì)胞因子，促進(jìn)B細(xì)胞成熟分泌IgE。同時本實(shí)驗(yàn)BALF 細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類以及肺組織切片均顯示嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）明顯升高，提示O3應(yīng)激可導(dǎo)致以EOS 浸潤為主的炎癥反應(yīng)。綜合以上分析，可以認(rèn)為O3應(yīng)激引發(fā)氣道高反應(yīng)，其機(jī)制可能與Th1 及Th2 類免疫反應(yīng)同時激活EOS 炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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