張丹麗，田雪，董常生

（山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷030801）

c－myc是在MC29鳥類轉錄病毒中被證實的具有轉化作用的癌基因，為myc基因家族成員之一，定位于人類染色體8q24［1］，其編碼的c－myc蛋白由439個氨基酸殘基組成［2］。c－myc為螺旋環(huán)螺旋／亮氨酸拉鏈家族的DNA結合蛋白，通過與Max作用，調控細胞增殖、分化及凋亡等重要生理功能［3］。研究表明c－myc高表達于脈絡膜惡性黑色素瘤細胞中并可作為其診斷依據(jù)［1］。國內外已有學者對一些物種的c－myc與毛發(fā)發(fā)育等方面進行過研究［4，5］。羊駝為毛用型經(jīng)濟動物，具有22種遺傳穩(wěn)定的自然毛色，是研究毛用動物毛色形成機制的理想型材料［6，7］。c－myc是否在羊駝皮膚組織中表達，它與羊駝毛色形成過程的關系如何，尚未有研究報道。因此，本試驗擬研究c－myc在羊駝皮膚中的定位，并通過檢測其在不同毛色羊駝皮膚中的蛋白表達情況，探索c－myc與毛色形成的關系，以期為c－myc參與毛色形成調控機制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料

隨機挑選3歲左右的棕色和白色雄性青年羊駝各3只，由山西農(nóng)業(yè)大學羊駝養(yǎng)殖基地提供。剃毛后用取皮器取1cm2左右皮膚組織1塊，置于Bouin’s固定液中固定，石蠟包埋后制成切片，用于免疫組織化學分析。

1．2 主要試劑和儀器

兔抗c－myc多克隆抗體，HRP－山羊抗兔IgG均購自北京博奧森生物技術公司；DAB顯色試劑盒購自武漢博世德生物工程有限公司。

1．3 免疫組織化學方法

將固定于Bouin’s固定液中的組織取出，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、修塊、切片，制成5μm厚的石蠟切片。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫水，用3%雙氧水滅活內源性過氧化物酶，PBS清洗3次（每次5min）。滴加封閉液，室溫放置20min。甩掉封閉液，滴加1∶80稀釋的一抗，室溫放置30 min后4℃過夜。取出后，室溫放置30min，PBS清洗后滴加二抗，37℃孵育20min。PBS清洗，滴加DAB顯色液顯色5～10min。PBS清洗，蘇木精輕度復染，脫水、透明后，中性樹膠封片。PBS替代一抗作為陰性對照。

光鏡下觀察切片，每只羊駝取3張切片，每張切片用DP軟件采集5個視野，對染色結果用Image－Pro Plus6．0軟件進行圖像分析，測定陽性反應物的平均光密度，進行吸光度分析。分析結果用平均值±標準誤（Mean±SE）表示。

2 結果和分析

免疫組織化學試驗結果見圖1。由圖1可見，免疫組織化學染色結果顯示，在棕色和白色羊駝皮膚組織切片中，毛囊毛球部細胞中存在c－myc蛋白棕黃色陽性反應，著色深淺不等，對照組未觀察到陽性細胞。對c－myc蛋白在不同毛色羊駝皮膚組織中的陽性細胞的平均光密度值進行測定比較（表1），結果顯示，c－myc在棕色和白色羊駝皮膚組織中陽性細胞的表達量差異極顯著（P＜0．01）。

圖1 羊駝皮膚組織c－myc免疫組織化學染色（放大倍數(shù)：×40）Fig．1 Expressions of c－myc protein in skin tissue of alpacas showed by immunohistochemical method（Magnification：×40）

表1 陽性表達細胞的平均光密度Table 1 Average optical density of c－myc positive cells in alpaca skin

3 討論

哺乳動物的毛色是由黑色素細胞產(chǎn)生的兩種不同類型的色素（真黑素和褐黑素）的分布及比例決定的［6］，其過程受多條信號通路調控，Wnt信號通路為其重要一條，它通過調節(jié)毛囊隆突部的毛囊干細胞與上皮細胞間的分化影響色素生成［8］。Irina［9］指出c－myc的缺失將影響黑色素干細胞的發(fā)育，使發(fā)揮正常功能的黑色素細胞數(shù)量減少。已有研究表明c－myc作為Wnt信號通路中的一個下游信號分子，該通路中的重要分子β－catenin能夠通過調控 Tcf－4從而激活c－myc的表達［10］。研究發(fā)現(xiàn)在羊駝皮膚毛囊毛球部存在c－myc陽性免疫反應物，且c－myc蛋白在棕色羊駝中表達量為白色羊駝的5．51倍，本實驗室于秀菊等證實β－catenin在棕色羊駝皮膚中的表達量顯著高于白色羊駝［11］。這與文獻所述兩者量的關系相一致。由于毛球部是產(chǎn)生并直接向毛干運輸黑色素的唯一部位［12］，因此推測β－catenin通過激活c－myc 的表達來影響羊駝毛色形成，但c－myc在羊駝毛色形成調控過程中的具體作用還有待于進一步的研究。本研究為c－myc參與羊駝毛色形成提供了一定的理論基礎。

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［3］Nair S K，Burley S K．X－Ray Structures of Myc－Max and Mad－Max Recognizing DNA［J］．Cell，2003，112：192－205．

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