楊寧，郝林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801)

一株地衣芽孢桿菌合成納米金的研究

楊寧，郝林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801)

以山西老陳醋醋醅中分離的一株地衣芽孢桿菌菌體（Bacilluslicheniformis)作為還原劑，以氯金酸（HAuCl4)為原料，采用生物法合成納米金粒子。研究結(jié)果顯示，通過紫外可見分光光度法、X射線衍射和透射電子顯微鏡鏡進(jìn)行了表征后，分析得到合成的納米金的紫外吸收峰值為545nm，其粒徑為15（±28%)nm，其結(jié)晶呈球形，為面心立方結(jié)構(gòu)。X射線衍射儀表征圖譜與已報道的納米金圖譜一致。

納米金;地衣芽孢桿菌;生物合成

食品檢測分析一般采用化學(xué)分析法（CA)、薄層層析法（TLC)、氣相色譜法（GC)、高效液相色譜法（HPLC)等，但前處理繁瑣，樣品損失大，操作要求高、儀器昂貴，不適合現(xiàn)場快速測定。以納米金為標(biāo)記物的免疫分析法有簡單快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣品量少等優(yōu)點，適合現(xiàn)場檢測，且金免疫層析技術(shù)正在向定量、半定量檢測和多元檢測方向發(fā)展，具有良好的發(fā)展前景。

傳統(tǒng)的制備納米金的方法主要是物理和化學(xué)方法。物理方法是指通過各種分散技術(shù)把金直接轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米粒子，化學(xué)方法是指由金的化合物通過還原反應(yīng)得到納米粒子。物理和化學(xué)方法需要嚴(yán)格的條件，耗能高，使用的試劑昂貴，還污染環(huán)境［1］。隨著綠色化學(xué)概念的普及，納米金的合成也向無毒、環(huán)境友好的方向發(fā)展，安全、環(huán)保的生物還原法應(yīng)運(yùn)而生。

采用生物材料或生物體系天然合成納米微粒是解決生態(tài)友好及可靠性問題的一種較好的方法。許多學(xué)者通過往微生物培養(yǎng)液的上清液或菌體浸泡液中加入一定濃度的氯金酸溶液，制備納米金粒子。國外研究者正在不斷探索和完善生物法來合成納米材料，國內(nèi)也有人開始研究，但相關(guān)成果報道較少，僅有東南大學(xué)的He S Y等成功地用紅假單胞菌的上清液合成了納米金粒子［2］。

采用前期從山西老陳醋醋醅中分離的一株地衣芽孢桿菌，合成了納米金粒子，并用紫外可見分光光度計、透射電鏡（SEM)和 X射線衍射儀（XRD)對其進(jìn)行了表征，研究了合成納米金的粒徑和形貌特征。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

氯金酸（購自sigma)、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、磷酸鹽緩沖液（pH7.0)。

1.1.2 菌種

地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis)，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室從山西老陳醋醋醅中分離得到的。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高速電動離心機(jī)：常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司

超聲波細(xì)胞破碎儀XO-900D：南京先歐儀器制造有限公司

高速冷凍離心機(jī)：維爾康湘鷹型號：TGL-22MC

紫外可見分光光度計：日本島津 UV-visible2400系列

透射電鏡：Jeol JEM-1400（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院分析測試中心)

X射線衍射儀（XRD)：德國布魯克（D8ADVANCE)（中國科學(xué)院山西煤炭化學(xué)研究所)

1.2 方法

1.2.1 地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)

將從山西老陳醋醋醅中分離得到的地衣芽孢桿菌接入牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，37℃，培養(yǎng)16h?；罨Y(jié)束后將菌種轉(zhuǎn)入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)，180r·min－1，37℃，16h。

1.2.2 地衣芽孢桿菌菌體的制備

將含有菌體的培養(yǎng)液離心，棄去上清液，取沉淀菌體4g。

將菌體用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0)清洗3次，洗掉菌體表面殘留的發(fā)酵液中的干擾物質(zhì)。取其中2g做細(xì)菌加熱滅活處理，作對照。

1.2.3 納米金的制備

將1.2.2洗凈的濕菌體和對照分別放入500 mL三角瓶中，加入100mL濃度為1mM的氯金酸溶液，放入搖床中，37℃，200r·min－1，孵育24 h。

1.2.4 樣品的超聲波制備

將三角瓶中的溶液離心后，取沉淀菌體，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0)清洗2次，將其置入10mL的磷酸鹽緩沖液中。將制備好的樣品放入超聲波細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行細(xì)胞破碎。

操作方法：破碎3次，每次15s，間隔為45s。超聲波破碎后的樣品放入高速冷凍離心機(jī)中，4℃，15 000r·min－1離心30min。棄去細(xì)胞碎片，取上清液，備用。對照處理同上［3］。

1.2.5 納米金的紫外吸收檢測

精密量取1.2.4的試樣和對照1mL于10 mL量瓶中，以雙蒸水稀釋至刻度，搖勻，用紫外可見分光光度計在300～800nm內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，檢測是否有合成納米金。

1.2.6 透射電鏡觀察［4］

將1.2.4制備的溶液，滴到敷有Formva膜的400目銅網(wǎng)上，空氣中干燥后，置透射電子顯微鏡（TEM)下觀察其大小和形狀。

1.2.7 X射線衍射表征

將1.2.4制備的納米金溶液離心，取沉淀。用雙蒸水洗掉殘余的細(xì)胞物質(zhì)，離心取沉淀，反復(fù)3次。將純化的沉淀分散于雙蒸水中，真空冷凍干燥。純化并干燥后的納米金用X射線衍射儀（XRD)進(jìn)行表征。衍射源為銅靶（Cu，Kα＝1.540 56A)。電壓40kV，電流300mA，掃描速度為每分鐘5。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶液顏色的變化

氯金酸溶液中加入地衣芽孢桿菌的活細(xì)胞后，溶液顏色變?yōu)榧t色。加入滅活的地衣芽孢桿菌后共同孵育24h，顏色始終未變。氯金酸溶液37℃放置24h，溶液顏色無變化。初步判定，在地衣芽孢桿菌活細(xì)胞的作用下，氯金酸溶液中的金離子被還原為納米金粒子。

2.2 紫外可見分光光度計檢測結(jié)果

由圖1可見，氯金酸溶液中加入地衣芽孢桿菌的活細(xì)胞后，溶液在545nm處有吸收峰。文獻(xiàn)表明［5，6］，據(jù)粒徑不同，納米金可選擇性地吸收和散射部分波長的光，其中以吸收為主，散射只占很小一部分。吸收的這部分光主要位于綠色光區(qū)域，波長范圍在520nm左右。據(jù)補(bǔ)色原理，納米金溶液因吸收綠色光，而呈紅色。所以，根據(jù)顏色變化結(jié)合紫外可見吸收光譜圖，證明在地衣芽孢桿菌活細(xì)胞的作用下，合成了納米金粒子。對照進(jìn)行紫外檢測沒有出現(xiàn)吸收峰，說明滅活的地衣芽孢桿菌不能把將［AuCl4］－還原為單質(zhì)Au。

圖1 納米金的紫外可見吸收光譜圖Fig.1 UV-vis spectra of the gold nanoparticles

2.3 透射電鏡（TEM)表征

采用透射電鏡（TEM)表征合成的納米金溶液。如圖2所示，所有合成的納米金粒子為近似球形，大小較均一。合成的納米金粒子的粒徑為15 nm（±28%)。

圖2 合成納米金的TEM照片F(xiàn)ig.2 TEM images of the gold nanoparticles

2.4 納米金的XRD表征

表征得到的納米金的X射線衍射（XRD)圖譜結(jié)果見圖3。與JCPDS標(biāo)準(zhǔn)卡對照一致，可以看出，2θ在38.3°、44.4°、64.76°、77.68°和81.9°處，出現(xiàn)的5個衍射峰均為金的特征衍射峰，分別與面心立方（FCC)結(jié)構(gòu) Au（111)、（200)、（220)、（311)和（222)晶面相對應(yīng)，由此確定產(chǎn)物為單質(zhì)金。經(jīng)比較X射線衍射圖譜與文獻(xiàn)［7］的研究一致。

圖3 納米金的X-射線圖譜Fig.3 XRD pattern of gold nanoparticles

圖中出現(xiàn)5個明顯的峰值，是因受到電子入射束輻照的樣品區(qū)域內(nèi)存在大量取向復(fù)雜的細(xì)小晶體顆粒，屬于多晶結(jié)構(gòu)。已研究出來的納米金大多數(shù)呈多晶結(jié)構(gòu)，也有少數(shù)單晶結(jié)構(gòu)。

2.5 納米金制備的機(jī)理

目前，已有大量關(guān)于生物法合成納米金粒子的報道，但其反應(yīng)機(jī)理還沒有定論?，F(xiàn)有資料多為一些推測性的研究成果，其中，對機(jī)理的推測不盡相同。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為NADH及其所依賴的還原酶在金離子的還原反應(yīng)中起重要作用。NADH廣泛存在于微生物的活細(xì)胞內(nèi)，是氧化還原反應(yīng)電子傳遞系統(tǒng)中的重要物質(zhì)。微生物產(chǎn)生并分泌出還原酶，該酶直接參與納米金粒子的合成過程。NADH為電子供體，還原酶為電子載體，金離子得到電子被還原為金屬態(tài)金［8～10］。

參與地衣芽孢桿菌合成納米粒子過程的酶可能為存在于該菌體內(nèi)的還原酶，將金離子還原為金屬態(tài)的金。NADH及NADH所依賴的還原酶是合成過程的重要因素。地衣芽孢桿菌可以分泌輔因子NADH及NADH所依賴的酶，尤其是還原酶。這些輔因子在金離子還原成金屬態(tài)金粒子形成的過程中起重要作用。

3 結(jié)論與討論

研究表明，采用山西老陳醋醋醅中分離得到的地衣芽孢桿菌的活菌體可有效地合成納米金粒子。經(jīng)紫外可見分光光度法和TEM表征合成的納米金的粒徑為15nm（±28%)，形態(tài)為近似球形。XRD表征圖譜與已報道的納米金圖譜一致。

目前，納米技術(shù)已與眾多學(xué)科交叉，滲透到食品領(lǐng)域，引起食品加工的巨大變革，給食品工業(yè)的發(fā)展帶來了新機(jī)遇。納米技術(shù)在食品領(lǐng)域的研究和應(yīng)用主要包括納米食品加工、納米包裝材料、納米機(jī)械和納米檢測技術(shù)等方面。采用生物法合成納米材料更安全，拓展納米材料在食品行業(yè)的應(yīng)用很必要。

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Biosynthesis of Gold Nanoparticles UsingBacilluslicheniformis

Yang Ning，Hao Lin
（CollegeofFoodScienceandEngineering，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China)

The bacteriumBacilluslicheniformiswas isolated from the fermentative crude grains of Shanxi mature vinegar and was used as the reducing agent，HAuCl4as raw material，to synthesize the gold nanoparticles.The characteristics of synthesized gold nanoparticles were analyzed with UV-vis spectroscopy，scanning electron microscopy（SEM)and X-ray diffraction（XRD).The absorbance peak of nanoparticles was observed at 545nm in UV-vis spectroscopy and the grain diameters were 15（±28%)nm.The shape of gold nanoparticles was spherical and face centered cubic structure（FCC).The X-ray diffraction（XRD)patterns displayed in this study were consistent with earlier reports.

Gold nanoparticles;Bacilluslicheniformis;Biosynthesis

S38

A

1671-8151（2013)03-0214-04

2013-02-22

2013-03-10

楊寧（1980-)，女（漢)，山西太谷人，講師，在讀博士，研究方向：生物工程。

郝林，教授，博士生導(dǎo)師。Tel： 18234465516;E-mail：haolinsxnd＠126.com

山西省自然科學(xué)基金（2011011032-1)