周龍 張建華 林進皇 俞雄杰 郁毅剛

火炮打擊兔應激防護模型腦組織病理及NMDA-R1表達的形態(tài)學研究

周龍 張建華 林進皇 俞雄杰 郁毅剛

目的 探討實彈演習火炮打擊后, 不同位置掩體保護下兔腦組織病理及NMDA-R1表達的變化。方法 閩南山地團進攻演習, 30只實驗兔隨機分為空白對照組, 反角隱蔽組和迎面隱蔽組?；鹋诖驌魬p傷后6 h, 各組存活兔取腦組織, 觀察其病理損傷形態(tài)學及NMDA-R1表達的變化。結(jié)果 與空白對照組比較, 反角隱蔽組和迎面隱蔽組NMDA-R1表達強陽性, 腦組織結(jié)構(gòu)層次被破壞, 神經(jīng)細胞變性壞死, 間質(zhì)出血；迎面隱蔽組NMDA-R1免疫反應強度亦高于反角隱蔽組。結(jié)論 火炮打擊后兔腦組織應激損傷反應強烈, 反角掩體保護能夠減輕腦組織損傷, NMDA-R1參與腦組織損傷病理過程。

火炮打擊；兔；應激防護模型；腦組織；NMDA-R1

正常情況下機體的應激反應是有利的, 有助于機體快速適應內(nèi)外環(huán)境因素的變化, 但過大過長的應激反應會對機體產(chǎn)生有害的影響, 產(chǎn)生病理性應激［1］。病理性應激是機體對嚴重應激因素(如創(chuàng)傷、打擊、爆炸等)的一種異常反應,其生理過程主要表現(xiàn)為下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamopituitary-adrenal, HPA)軸神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能紊亂, 導致持續(xù)過度的糖皮質(zhì)激素升高［2］。近年來, 人們發(fā)現(xiàn)N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAr)的變化與創(chuàng)傷后神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能紊亂的發(fā)生機制有關(guān)［3］。本課題通過建立火炮打擊兔應激防護模型, 進行應激狀態(tài)下兔腦組織病理變化及NMDA-R1表達的形態(tài)學研究, 現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、動物及試劑 團進攻炮火覆蓋火力類型：武裝直升機火箭彈、XX自行榴彈炮、XX牽引加農(nóng)炮、XX自行火箭炮、水陸兩棲坦克、XX輪式突擊炮、XX迫擊炮、XX反坦克導彈。健康成年日本大耳白兔30只, 雌雄不拘,清潔級, 體質(zhì)量2.5～3.0 kg(廈門大學醫(yī)學院動物中心提供),隨機表法分為3組, 空白對照組6只, 反角隱蔽組6只, 迎面隱蔽組18只(距離攻擊目標10 m隱蔽組6只, 20 m隱蔽組6只, 3 0 m組隱蔽6只)。

1.2 實驗方法 按照文獻［4］方法設計實驗, 實驗時間和環(huán)境條件為南方秋季中午山地環(huán)境, 環(huán)境溫度16℃～28℃, 濕度43%～65%。實驗兔常規(guī)喂養(yǎng), 演習當日凌晨運至目標高地,炮靶前迎面10 m、20 m、30 m處挖掘約1 m深掩體, 各放置實驗兔6只, 上覆蓋硬質(zhì)木板、松枝, 留通氣道。炮靶后反角10 m處挖掘同樣掩體, 放置實驗兔6只?？瞻讓φ战M于炮靶陣地外10 km營區(qū)喂養(yǎng)。中午演習開始, 全過程2 h。轟炸機俯沖(未投彈), 持續(xù)火炮急襲5 min。各型火炮、坦克、導彈、武裝直升機集群連續(xù)發(fā)彈若干, 期間暫停兩次, 各10 min。演習結(jié)束, 工兵排爆清理陣地后進場取回實驗兔。傷后6 h處死存活兔解剖, 取腦組織標本, 4%甲醛固定。

1.3 腦組織病理檢測 取4%甲醛固定腦組織, 石蠟包埋,切片行HE染色, 光鏡下觀察形態(tài)學變化, 由同一病理醫(yī)生采用盲法評價。觀察腦組織結(jié)構(gòu)層次是否完整, 神經(jīng)細胞腫脹、變性、壞死, 間質(zhì)出血、水腫等情況。

1.4 腦組織NMDA-R1免疫組化表達的測定 取4%甲醛固定腦組織, 石蠟包埋, 連續(xù)切片(4 μm), 每例標本切5張免疫組化染色用。采用改進型SP法進行免疫組化染色, 嚴格參照試劑盒說明操作。試劑盒型號, 購于XX公司。每次染色時均用已知陽性切片作陽性對照, 用PBS(磷酸緩沖液, 0.01 mol/L, pH值7.2)代替一抗作陰性對照。NMDA-R1表達均位于胞質(zhì)和胞核內(nèi), 表現(xiàn)為淺黃、棕黃或棕褐色。用半定量法評估其染色, 無陽性細胞數(shù)為(-), 陽性細胞數(shù)25%以下為(+), 25%～50%為(++), 51%～75%為(+++), 超過75%為(++++)。

2 結(jié)果

2.1 兔一般情況 各組實驗兔均無直接火力命中。與空白對照組比較, 反角隱蔽組實驗兔全部存活, 部分精神萎靡,反應遲鈍, 伏地, 少部分耳道出血。因彈著點不規(guī)律, 迎面隱蔽3組距離無差異, 合并為1組。迎面隱蔽組18只實驗兔當場死亡9只, 至傷后6 h取腦組織標本前再死亡3只,死亡率達66.7%(12/18)。剩余6只存活實驗兔編為迎面隱蔽組, 與另外兩組同時刻點取腦組織進行病理形態(tài)學及組化檢測, 每只取五張切片進行組化表達強度及形態(tài)學觀察研究。

2.2 腦組織HE染色結(jié)果 空白對照組腦組織切片HE顯示, 分子層, 內(nèi)、外顆粒層及錐體細胞層結(jié)構(gòu)完整, 均勻致密；錐體細胞數(shù)量豐富, 胞體致密, 核居中, 軸突完整、干凈,向四周延伸；間質(zhì)為少量血管及白質(zhì), 肌漿深染, 膠質(zhì)豐富,可見散在分布血管, 腔內(nèi)可見少量紅細胞, 未見炎癥細胞(圖1、圖2)。反角隱蔽組腦組織切片HE顯示, 分層結(jié)構(gòu)存在,錐體細胞數(shù)量減少, 胞體稍腫脹, 可見空泡變性, 軸突斷裂；細胞間少量紅細胞分布, 間質(zhì)少量炎細胞浸潤(圖3、圖4)。迎面隱蔽組腦組織切片HE染色顯示, 細胞結(jié)構(gòu)層紊亂, 分界不清, 部分壞死, 崩解；細胞數(shù)明顯減少, 胞體腫脹, 體積增大, 軸突消失, 白質(zhì)稀疏；間質(zhì)充血, 可見散在紅細胞分布及漿細胞浸潤(圖5、圖6)。

2.3 腦組織NMDA-R1免疫組化的表達 各組神經(jīng)元錐體細胞中均有NMDA-R1表達, 主要在神經(jīng)元膜表面表達, 免疫反應強度有差異。空白對照組可見神經(jīng)元形態(tài)完整、胞膜淡染, NMDA-R1蛋白少量表達(+)(圖7、圖8)。反角隱蔽組可見神經(jīng)元胞體腫脹, 細胞數(shù)量減少, 細胞膜典型黃染, NMDA-R1中量表達(++)(圖9、圖10)。迎面隱蔽組, 可見大量神經(jīng)元壞死崩解, 殘存神經(jīng)元形態(tài)數(shù)量稀少, 胞體腫脹, 體積巨大, 胞核溶解, 大部分胞質(zhì)、胞膜均黃染, 色深, NMDA-R1大量表達(++++)(圖11、圖12)。迎面隱蔽組、反角隱蔽組NMDA-R1免疫反應強度均高于對照組, 同時迎面隱蔽組NMDA-R1免疫反應強度亦高于反角隱蔽組。

圖1 空白組HE染色(×100)

圖2 空白組HE染色(×400 )

圖3 反角組HE染色(×100)

圖4 反角組HE染色(×400)

圖5 迎面組HE染色(×100)

圖6 迎面組HE染色(×400 )

圖7 空白組Nr1組化(×100)

圖8 空白組Nr1組化(×400)

圖9 反角組Nr1組化(×100)

圖10 反角組Nr1組化(×400)

圖11 迎面組Nr1組化(×100)

圖12 迎面組Nr1組化(×400)

3 討論

爆炸及爆炸應激性腦損傷是戰(zhàn)爭中人員遭受的一種多發(fā)而又嚴重的顱腦損傷, 在美軍近年的軍事行動中, 爆炸沖擊波性腦損傷的發(fā)生率約為40%～60%, 約有32萬服役人員或戰(zhàn)士遭受過爆炸沖擊波腦損傷［5］, 即使爆炸外圍沒有直接受到?jīng)_擊波影響的戰(zhàn)士, 也因爆炸應激性損傷而導致腦組織及細胞發(fā)生相應的生理病理變化［6］。有報道顯示［2］, HPA軸系統(tǒng)在應激反應調(diào)控中的作用與NMDA-R活化有著密切的聯(lián)系。因此, 為了了解爆炸及爆炸應激狀態(tài)下腦組織損傷的病理生理機制, 作者建立火炮打擊兔應激防護模型, 進行應激狀態(tài)下兔腦組織病理變化及NMDA-R1表達的形態(tài)學研究。結(jié)果提示：與空白對照組比較, 反角隱蔽組和迎面隱蔽組腦組織病理切片及免疫組化均可見腦細胞結(jié)構(gòu)層紊亂, 部分神經(jīng)元變性、壞死、崩解, 細胞數(shù)減少, 胞體腫脹, 體積增大, 胞核溶解, 細胞間質(zhì)充血, 漿細胞浸潤等腦組織損傷的病理表現(xiàn), 并且迎面隱蔽組上述表現(xiàn)更明顯和嚴重。同時, 迎面隱蔽組腦組織NMDA-R1大量表達(++++), 反角隱蔽組腦組織NMDA-R1中量表達(++), 而空白對照組腦組織NMDA-R1少量表達(+), 與腦組織病理損傷結(jié)果具有一致性。以上結(jié)果表明, NMDA-R1參與了爆炸及爆炸應激狀態(tài)下腦組織病理損傷過程。

NMDA-R是一種興奮性氨基酸的特異性離子型受體, 它與學習、記憶及神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育的可塑性都有密切關(guān)系,主要分布于大腦皮層、丘腦、紋狀體、海馬等的突出后膜上, NMDA-R通道對Ca2+具有高度通透性, 在正常生理條件下, 由于離子通道內(nèi)部Mg2+的阻滯作用, 通道并不開放［7,8］。NMDA-R參與興奮性突觸傳遞、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等生理活動,其參與腦組織病理損傷的機制為：①NMDA-R1激活HPA軸促進腎上腺皮質(zhì)激素的分泌和釋放。Son等［9］通過實驗證實應激狀態(tài)下腦海馬內(nèi)NMDA-R1水平存在明確的改變。嚴重創(chuàng)傷應激后海馬NMDA-R激活, 下調(diào)海馬糖皮質(zhì)激素受體進而影響糖皮質(zhì)激素在海馬水平的負反饋調(diào)節(jié), 導致HPA軸亢進, 內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素過度增多［10,11］。現(xiàn)已證實, 過度升高的內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素是病理性應激損傷的主要因素之一, 影響神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性［12］。②介導興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì), NMDA-R是其特異性離子型受體, 腦損傷時腦細胞外谷氨酸濃度大量增加, NMDA-R1迅速被激活, 并誘導神經(jīng)元興奮毒性、激發(fā)神經(jīng)元的退化及神經(jīng)細胞死亡等過程。岳少杰等［13］研究表明谷氨酸可致膠質(zhì)細胞的腫脹、壞死及海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡；Ros等［14］也報道谷氨酸可導致大腦皮層損害。③參與繼發(fā)性腦組織水腫及創(chuàng)傷應激產(chǎn)物的形成。有報道證實［15］：NMDA-R1過度激活可介導Na+主動內(nèi)流,隨即Cl-、水被動內(nèi)流, 神經(jīng)細胞急性滲透性腫脹；同時, 其過度興奮介導的神經(jīng)元遲發(fā)性損傷, 以Ca2+內(nèi)流為特征并激活膜磷脂酶活性, 引起白細胞三烯、前列腺素和花生四烯酸等產(chǎn)生增多, 導致脂質(zhì)過氧化和自由基形成, 激活各種蛋白酶導致細胞骨架降解, 細胞裂解。④介導炎癥反應性損傷, NMDA-R數(shù)量的增加可導致細胞對炎癥的敏感化, 加重繼發(fā)性炎癥反應性腦損傷, 而NMDA-R在神經(jīng)細胞膜上的表達量是調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞炎癥應激強度的關(guān)鍵［16］。

綜上所述, 通過觀察實彈演習對火炮打擊兔應激防護模型的實驗研究, 作者探討戰(zhàn)場環(huán)境下火炮打擊應激復合損傷-保護因素對腦組織病理損傷的特點, 為戰(zhàn)爭環(huán)境下顱腦爆炸沖擊及爆炸應激傷的診治提供了新的思路。

［1］ Rosch PJ.Reminiscences of hans selye, and the birth of “stress”.Int J Emerg Ment Health, 1999, 1(1):59-66.

［2］ 陸建華, 黎海蒂, 高京生.應激時NMDA受體活性變化對HPA軸興奮性的影響研究進展.西南國防醫(yī)藥, 2002, 12(4):367-370.

［3］ 陸建華, 黎海蒂, 高京生.燙傷大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體亞型基因表達的變化.中華燒傷雜志, 2002, 18(3):180-182.

［4］ 林也容, 張?zhí)m, 李娟, 等.火炮打擊兔應激防護模型卵巢病理及P38表達的形態(tài)學研究.臨床和實驗醫(yī)學雜志, 2013, 12(18):1437-1439.

［5］ Ling G, Bandak F, Armonda R, et al.Explosive blast neurotrauma.J Neurotrauma, 2009, 26(6): 815-825.

［6］ 李創(chuàng)忠, 王運杰.爆炸沖擊波性腦損傷的研究進展.臨床軍醫(yī)雜志, 2010, 38(2):311-315.

［7］ 魏郢, 張曉琴.癲癇與NMDA受體的研究進展.腦與神經(jīng)疾病雜志, 2009, 17(3):237-239.

［8］ Banke TG, Traynelis SF.Activation of NR1/NR2B NMDA receptors.Nat Neurosci, 2003, 6(2):144-152.

［9］ Son GH, Geum D, Chung S, et al.Maternal stress produces learning deficits associated with impairment of NMDA receptor-mediated synaptic plasticity.J Neurosci, 2006, 26(12):3309-3318.

［10］ 葉建寧, 陸建華, 熊加祥.海馬NMDA受體調(diào)節(jié)嚴重燙傷應激后HPA軸興奮性的相關(guān)機制研究.中華神經(jīng)醫(yī)學雜志, 2006, 5(10):982-985.

［11］ 周濟, 顧曉紅, 李兵, 等.大鼠嚴重燒傷后早期下丘腦NMDA受體NRl和NR2B亞基的表達.中華創(chuàng)傷雜志, 2012, 28(3):272-276.

［12］ 王竹風, 汪寶軍, 岳廣欣, 等.逍遙散對慢性束縛應激下腦區(qū)NMDA受體NR2A和NR2B表達的影響.北京中醫(yī)藥, 2013, 32(4):300-304.

［13］ 岳少杰, 陳檢芳, 陶永光, 等.清開靈對腦組織谷氨酸含量及NMDA受體的影響.湖南醫(yī)科大學學報, 2000, 25(3):213-215.

［14］ Ros J, Pecmska N, Alessandri B, et al.Lactate reduces glutamateinduced neurotoxicity in rat cortex.J Neurosci Res, 2001, 66(5): 790-794.

［15］ 黃曉磊, 王樹禮, 夏作理.谷氨酸、NMDA受體1與缺血性腦損傷關(guān)系研究進展.中國微循環(huán), 2006, 10(1):69-72.

［16］ 沈蕾, 錢偉, 楊小軍, 等.大鼠腸道神經(jīng)元NR1表達與急性束縛應激所致內(nèi)臟高敏感的關(guān)系.中華醫(yī)學雜志, 2009, 89(14):939-942.

Morphological study on NMDA-R1 expression and pathology research on injury brain tissue of artillery attacking stress protective rabbits model

ZHOU Long, ZHANG Jian-hua, LIN Jin-huang, et al.Department of Trauma Neurosurgery, 175th Hospital of PLA Dongnan Hospital Affiliated to Xiamen University, Zhangzhou 363000, China

Objective To study the NMDA-R1 expression and pathology on injury brain tissue in rabbits hidden in different positions of blindage after real artillery attacking in battlefield.Methods 30 Japanese white rabbits were randomly divided into 3 groups, blank group, reverse hidden group and frontage hidden group in mountain regiment artillery attacking maneuver at southern of Fujian.The NMDA-R1 expression and pathology on injury brain tissue in rabbits were observed and recorded in 6 hours after injury.Results Compared with the blank group, the NMDA-R1 expression in reverse hidden group and frontage hidden group were strong positive, brain tissue structure were destroyed, nerve cells degeneration necrosis and brain tissue i nterstitial hemorrhage.Tthe NMDA-R1 expression in frontage hidden group were stronger than reverse hidden group.Conclusion The stress injury response is very strong in rabbits attacked by artillery, reverse blindage protection can reduce degree of brain tissue injury, NMDA-R1 participates in brain tissue injury pathological process.

Artillery attack; Rabbit; Stress protective model; Brain tissue; NMDA-R1

全軍十一五醫(yī)學科研基金面上項目(項目編號：06MB152)；福建省漳州市科技計劃項目(項目編號：Z10071)；南京軍區(qū)醫(yī)學科技計劃項目(項目編號：12MA065)

363000 漳州,解放軍第一七五醫(yī)院暨廈門大學附屬東南醫(yī)院神經(jīng)外科(周龍 林進皇 郁毅剛)；解放軍73131部隊(張建華 俞雄杰)

郁毅剛 E-mail：yu-yg@tom.com