章松柏， 夏宣喜， 張 潔， 張友軍， 吳祖建＊

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福州 350002；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，荊州 434025）

棉花曲葉?。╟otton leaf curl disease）是世界棉花生產(chǎn)上最具毀滅性的病毒病害，已在巴基斯坦、印度、蘇丹、埃及和南非等國(guó)棉花產(chǎn)區(qū)廣泛流行，僅在1992－1997年期間就造成巴基斯坦經(jīng)濟(jì)損失累計(jì)達(dá)50億美元［1－4］。棉花曲葉病是多種雙生病毒引起，這些雙生病毒都屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）成員［3，5－6］，皆由煙粉虱［Bemisia tabaci （Genn.）］以持久方式傳播，也可以嫁接傳播，但不能通過(guò)機(jī)械摩擦接種傳播和種子帶毒傳播；其基因組僅含有DNA－A組分，并伴隨衛(wèi)星β分子［3－4］。鑒于棉花曲葉病的危害性，2007年5月28日正式發(fā)布實(shí)施的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中，再次將其列入植物檢疫對(duì)象。盡管如此，棉花曲葉病的主要病原之一，木爾坦棉花曲葉病毒，還是很快在我國(guó)朱槿（Hibiscus rosa－sinensis Linn.）植物上被發(fā)現(xiàn)［7］，經(jīng)過(guò)不到8年的擴(kuò)散，該病毒已經(jīng)在我國(guó)廣東、廣西、海南等省多個(gè)地理區(qū)域的多種植物上流行危害，其他省市，包括我國(guó)長(zhǎng)江流域、黃河流域和西北內(nèi)陸三大棉花產(chǎn)區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)棉花曲葉病［7－11］。因此，密切監(jiān)視和防控CLCuMV引起的病害擴(kuò)散是各級(jí)植保植檢部門和科研工作者的重要任務(wù)。2011－2012年，實(shí)驗(yàn)室科研人員先后于福建省廈門、福州、寧德等市公路綠化帶發(fā)現(xiàn)朱槿曲葉病疑似病株，并詳細(xì)調(diào)查了該病在福州市的發(fā)生情況。經(jīng)過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)福州市城市道路、公園、工廠、學(xué)校、政府機(jī)關(guān)等多數(shù)存在朱槿植物的綠化帶以及位于市郊的絕大多數(shù)苗圃基地皆存在疑似病株，經(jīng)過(guò)分子檢測(cè)和序列比較，證實(shí)該病害病原為木爾坦棉花曲葉病毒，傳毒介體為B型煙粉虱，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

植物樣品：朱槿曲葉病疑似病株葉片和健株葉片采集于福州市郊區(qū)苗圃基地，液氮速凍后保存于－70℃超低溫冰箱中備用，陽(yáng)性對(duì)照樣品為已經(jīng)鑒定的苧麻花葉病毒病病株。

介體昆蟲(chóng)：煙粉虱種群分別采自福州市郊區(qū)朱槿健株和疑似病株以及煙草上，收集于含75%乙醇的1.5mL離心管中，保存于－70℃超低溫冰箱或－20℃冰箱中備用。

1.2 實(shí)地調(diào)查和癥狀觀察

調(diào)查福州市種植朱槿的公園、道路、單位和苗圃基地，走訪苗圃基地花農(nóng)，記錄朱槿曲葉病的發(fā)生時(shí)間和可能的傳入途徑；對(duì)照健康植株，觀察發(fā)病朱槿植株葉片是否畸形和黃化，葉片大小是否變化，葉背有無(wú)耳突，葉脈是否增厚等，植株是否矮化等。

1.3 植物總DNA和煙粉虱DNA的提取

采用周雪平等報(bào)道的CTAB提取法［12］提取朱槿葉片中的總DNA（總共有14份植物樣品，包括病葉樣品12份、健葉樣品1份，對(duì)照樣品1份）。

煙粉虱生物型的鑒定使用多頭昆蟲(chóng)（30～50頭）提取的DNA，方法如下：將煙粉虱置于1.5mL離心管中，液氮速凍后，用研磨棒研磨成粉狀，加入含200μL 堿 裂 解 液 （50mmol／L Tris－HCl，pH 8.0，20mmol／L NaCl，1mmol／L EDTA，1%SDS）和1μL蛋白酶K（終濃度1μg／mL），55℃水浴鍋中水浴2～3h；離心（12000r／min，下同）5min后取上清，加入200μL 24∶1的氯仿／異戊醇抽提，重復(fù)1次；離心5min后取上清，加入等體積的異丙醇，－20℃放置20min；離心10min，去上清，沉淀用70%乙醇洗1次，然后將DNA沉淀室溫晾干，加入60μL ddH2O溶解后即可用于PCR反應(yīng)。煙粉虱帶毒率監(jiān)測(cè)使用朱槿曲葉病病株上采集的煙粉虱，單頭煙粉虱總DNA的提取方法參照潘慧鵬等［13］。

1.4 PCR擴(kuò)增和電泳

利用Shatters等［14］基于B型和Q型煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增特異性引物來(lái)鑒定煙粉虱的生物型是B型還是Q型；利用謝艷等［15－16］設(shè)計(jì)的雙生病毒通用引物來(lái)檢測(cè)福州朱槿曲葉病是否由雙生病毒引起，并在序列分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)擴(kuò)增DNA－A余下片段的引物。PCR熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃4min，94℃20s，55℃20s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖（0.5×TBE）電泳檢測(cè)，BioRad凝膠成像儀觀察，記錄結(jié)果。

1.5 檢測(cè)片段克隆和序列分析

雙生病毒通用引物PCR擴(kuò)增所得的檢測(cè)片段連接pMD 18－T （TaKaRa），轉(zhuǎn)化克隆驗(yàn)證后委托南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。運(yùn)用DNAMAN軟件（Lynnon Biosoft Inc.）對(duì)所獲序列進(jìn)行加工整理和同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 福州市朱槿曲葉病危害現(xiàn)狀

通過(guò)與苗圃基地花農(nóng)們座談得知，福州朱槿苗木最初由廣東調(diào)運(yùn)而來(lái)，隨后經(jīng)過(guò)枝條扦插繁殖而擴(kuò)大種植；朱槿疑似曲葉病最早發(fā)生于2009年，當(dāng)時(shí)只有零星苗圃發(fā)生，經(jīng)過(guò)3年時(shí)間已經(jīng)擴(kuò)散至福州市各苗圃基地、多數(shù)綠化帶以及周邊縣市。因此，推測(cè)該病隨苗木調(diào)運(yùn)而傳入福州地區(qū)。福州市朱槿曲葉病發(fā)病癥狀和已報(bào)道的朱槿曲葉病癥狀一致，如封面所示：發(fā)病朱槿植株和枝條都明顯矮化；新葉黃化明顯；葉片畸形，變小，老葉和新葉皆向上卷曲，呈杯狀或勺狀；葉脈增大、明脈或脈突，葉片背面粗糙不平且于葉脈處產(chǎn)生耳突；較大的朱槿病株都能正常開(kāi)花，但花較健康略小，但較小的苗木多數(shù)不能正常開(kāi)花。

2.2 朱槿曲葉病的PCR檢測(cè)和鑒定

應(yīng)用雙生病毒的通用引物（PA／PB）對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，樣品1～12號(hào)都能得到預(yù)期約480bp大小的片段（見(jiàn)圖1）。選擇樣品1～6進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)片段的序列完全一致。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增DNA－A余下約2260bp片段（以樣品1～6的總DNA為模板，擴(kuò)增結(jié)果如圖1中13～18泳道），并予以測(cè)序。DNA－A全長(zhǎng)序列（GenBank登錄號(hào)：JX861210）分析比較如圖2所示，在引起棉花曲葉病的8種病毒中，檢測(cè)樣品的DNA－A序列與CLCuMV相似性最高，其中與CLCuMV廣東分離物（JX286664）和廣西分離物（JQ317603）的相似性高達(dá)99.6%以上，說(shuō)明引起福州朱槿曲葉病的病原是CLCuMV。

圖1 福州朱槿曲葉病的PCR檢測(cè)及DNA－A的擴(kuò)增Fig.1 PCR detection of leaf curl disease on H.rosa－sinensis plants and PCR amplification of the geminivirus DNA－A

圖2 基于雙生病毒的DNA－A核酸全序列構(gòu)建的親緣關(guān)系樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on complete sequence of Begomovirus DNA－A

2.3 煙粉虱生物型鑒定和煙粉虱帶毒率檢測(cè)

煙粉虱生物型鑒定應(yīng)用相應(yīng)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，用鑒定B型煙粉虱的特異性引物PCR擴(kuò)增能得到預(yù)期的、約480 bp大小的DNA產(chǎn)物（B1～B6），而用鑒定Q型的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未得到預(yù)期的、約300bp大小的DNA帶條（Q1～Q6），說(shuō)明采集于煙草和健康或發(fā)病朱槿上的煙粉虱生物型是B型。

朱槿病株上煙粉虱的帶毒率應(yīng)用引物PA／PB進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以已經(jīng)鑒定的病株和健株上采集的煙粉虱分別做陽(yáng)性和陰性對(duì)照，結(jié)果如圖4所示。22頭朱槿病株上采集的煙粉虱樣品PCR擴(kuò)增皆能得到預(yù)期的、約480bp大小的DNA條帶，所檢測(cè)的煙粉虱帶毒率100%，說(shuō)明煙粉虱的帶毒效率很高。

3 討論

試驗(yàn)證實(shí)福州市朱槿曲葉病是由CLCuMV侵染引起的。CLCuMV是引起棉花曲葉病的主要病原之一，而棉花曲葉病是棉花生產(chǎn)上最具毀滅性的病毒病害，多次在巴基斯坦、印度、蘇丹、埃及和南非等國(guó)棉花產(chǎn)區(qū)暴發(fā)流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3－4］。已報(bào)道從棉花曲葉病樣中檢測(cè)到8種雙生病毒［3，8］，分別為木爾坦棉花曲葉病毒（CLCuMV）、阿拉巴德棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Alabad virus，CLCuAV）、Kokhran棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Kokhran virus，CLCuKV）、番木瓜曲葉病毒（Papaya leaf curl virus，PaLCuV）、杰濟(jì)拉棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Gezira virus，CLCuGV）、拉賈斯坦棉花曲葉病毒 （Cotton leaf curl Rajasthan virus，CLCuRV）、班加羅爾番茄曲葉病毒 （Tomato leaf curl Bangalore virus，ToLCBV）和布里瓦拉棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Burewala virus，CLCuBuV），這8種病毒在自然條件下由煙粉虱以持久方式傳播，也可以嫁接傳播，不能通過(guò)其他方式傳播，自然寄主包括棉花、黃秋葵、朱槿、垂花懸鈴花和蔟生黃麻等植物［8］。目前，我國(guó)長(zhǎng)江流域、黃河流域和西北內(nèi)陸三大棉花產(chǎn)區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)棉花曲葉病毒危害，但在廣東、廣西、海南3省已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CLCuMV危害朱槿、黃秋葵等植物，危害范圍日益擴(kuò)大［7－11］。與廣西情況相似［8］，福建的朱槿苗木最初也是主要來(lái)源于廣東，經(jīng)過(guò)若干年的發(fā)展，朱槿已經(jīng)成為城市公路、公園、工廠、學(xué)校、政府機(jī)關(guān)等常用的綠化植物。由于CLCuMV福州分離物DNA－A與廣東分離物的相似性高達(dá)99.6%以上，推測(cè)CLCuMV可能是通過(guò)朱槿的苗木調(diào)運(yùn)而從廣東省入侵福建省的。入侵后的CLCuMV經(jīng)過(guò)B型煙粉虱在苗圃間傳播，同時(shí)病枝扦插繁殖、苗木交易加速了病毒病的發(fā)生和蔓延擴(kuò)散。更為重要的是，朱槿和棉花同屬錦葵科，且我國(guó)廣西已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有CLCuMV危害棉花的報(bào)道［17］，如果該病毒分離物一旦入侵棉區(qū)，勢(shì)必造成嚴(yán)重后果。此外，試驗(yàn)也驗(yàn)證了福州市朱槿曲葉病病株上煙粉虱的生物型是B型，該生物型是我國(guó)煙粉虱種群中的優(yōu)勢(shì)種，南北多數(shù)省市均有分布，攜帶和傳播棉花曲葉病毒的能力較強(qiáng)。因此有必要在廣東、廣西、海南、福建等省開(kāi)展對(duì)木爾坦棉花曲葉病毒引起的植物病害綜合治理研究，以控制其擴(kuò)散和蔓延，特別要警惕CLCuMV隨煙粉虱傳播、擴(kuò)散至內(nèi)陸棉區(qū)暴發(fā)流行。

［1］ Goodman R M.Single－stranded DNA genome in a whiteflytransmitted plant virus［J］.Virology，1977，83（1）：171－179.

［2］ Boulton M I.Geminiviurses：Major threats to world agriculutre［J］.Annals of Applied Biology，2003，142（2）：143.

［3］ Amjad Farooq，Jehanzeb Farooq，Abid Mahmood，et al.An overview of Cotton leaf curl virus disease（CLCuD）a serious threat to cotton productivity［J］.Australian Journal of Crop Science，2011，5（13）：1823－1831.

［4］ Briddon R W，Markham P G.Cotton leaf curl virus disease［J］.Virus Research，2000，171（1－2）：151－159.

［5］ Fauquet C M，Briddon R W，Brown J K，et al.Geminivirus strain demarcation and nomenclature［J］.Archives of Virology，2008，153（4）：783－821.

［6］ 洪健，李德葆，周雪平.植物病毒分類圖譜［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：28－38.

［7］ 毛明杰，何自福，虞皓，等.侵染朱槿的木爾坦棉花曲葉病毒及其衛(wèi)星 DNA全基因組結(jié)構(gòu)特征［J］.病毒學(xué)報(bào)，2008，24（1）：64－68.

［8］ 何自福，佘小漫，湯亞飛.入侵我國(guó)的木爾坦棉花曲葉病毒及其為害［J］.生物安全學(xué)報(bào)，2012，21（2）：87－92.

［9］ 董迪，朱艷華，何自福，等.侵染廣東黃秋葵的木爾坦棉花曲葉病毒及伴隨衛(wèi)星DNA的分子特征［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（1）：33－39.

［10］何自福，董迪，李世訪，等.木爾坦棉花曲葉病毒已對(duì)我國(guó)棉花生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅［J］.植物保護(hù)，2010，36（2）：147－149.

［11］林林，蔡健和，羅恩波，等.南寧市朱槿曲葉病毒病病原分子鑒定和寄主范圍研究［J］.植物保護(hù)，2011，37（4）：44－47.

［12］周雪平，戚益軍，李德葆.從棉花組織中提取棉花曲葉病毒基因組 DNA之方法［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1999，7（2）：169－172.

［13］潘慧鵬，戈大慶，王少麗，等.在北京和河北局部地區(qū)Q型煙粉虱取代了B型煙粉虱［J］.植物保護(hù)，2010，36（6）：40－44.

［14］Shatters R G J，Powell C A，Boykin L M，et al.Improved DNA barcoding method for Bemisia tabaci and related Aleyrodidae：development of universal and Bemisia tabaci biotypespecific mitochondrial cytochrome c oxidase I polymerase chain reaction primers［J］.Journal of Economic Entomology，2009，102（2）：750－758.

［15］Zhou X P，Xie Y，Zhang Z K.Molecular characterization of a distinct begomovirus infecting tobacco in Yunnan，China［J］.Archives of Virology，2001，146（8）：1599－1606.

［16］Xie Y，Zhou X P.Molecular characterization of squash leaf curl Yunnan virus，a new begomovirus and evidence for recombination［J］.Archives of Virology，2003，148（10）：2047－2054.

［17］Cai J H，Xie K，Lin L，et al.Cotton leaf curl Multan virus newly reported to be associated with cotton leaf curl disease in China［J］.Plant Pathology，2010，59，（4）：794－795.