呂祝邦， 李敏權(quán)，2＊， 惠娜娜， 王 立，漆永紅， 馬永強， 苓 強， 李繼平＊

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，蘭州 730070；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，蘭州 730070）

當(dāng)歸［Angelica sinensis （Oliv.）Diels］為傘形科植物，藥用歷史悠久，是中國大宗常用中藥材［1］。甘肅當(dāng)歸種植歷史悠久，早在西漢初就有記載［2］。隨著中藥材種植產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，甘肅省當(dāng)歸的種植面積近年來逐年增加，2011年全省種植面積達(dá)2.60萬hm2，其中定西市1.67萬hm2，占全省種植面積的64.06%。定西當(dāng)歸質(zhì)量好、品質(zhì)佳，2001年定西市岷縣被國家命名為“中國當(dāng)歸之鄉(xiāng)”，“岷歸”遠(yuǎn)銷東南亞、港澳臺及歐美等地20多個國家和地區(qū)，被歐洲人譽為“中國婦科人參”。

一些學(xué)者報道了當(dāng)歸麻口病、褐斑病、軟腐病等［3－5］，對病原和致病機理進(jìn)行了研究。王玉娟［6］等報道了當(dāng)歸“水爛病”，認(rèn)為細(xì)菌和真菌都可引起該病，但目前尚未對致病病原進(jìn)行系統(tǒng)研究。近年來，由于降水量增多“水爛病”在定西市岷縣、漳縣、渭源等地嚴(yán)重發(fā)生，造成田間早期大量死苗，嚴(yán)重影響當(dāng)歸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，本試驗從病原形態(tài)特征、生理生化特性及16SrDNA序列分析入手，對甘肅省當(dāng)歸水爛病病原及其對不同品種當(dāng)歸的致病性進(jìn)行研究，旨在為深入開展該病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律研究、綜合防治以及當(dāng)歸的抗病育種等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及鏡檢

2009－2011年在定西市岷縣、漳縣、渭源等當(dāng)歸種植區(qū)采集水爛病病樣，品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N‘岷歸1號’，描述癥狀并拍照，實驗室鏡檢，發(fā)現(xiàn)有溢菌現(xiàn)象。

1.2 供試培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：酵母浸膏1g，牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，蔗糖10g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，pH 7.0。

KB培養(yǎng)基：硫酸鎂（MgSO4·7H2O）1.5g，磷酸氫二鉀（K2HPO4）1.5g，甘油10g，蛋白胨20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH 7.2。

1.3 病原菌的分離與純化

在病健交界處剪取病樣，3%的次氯酸鈉浸泡3min，無菌水沖洗3次，用玻璃棒將組織搗碎靜止片刻，在NA平板上劃線，28℃下培養(yǎng)48h，挑取單菌落轉(zhuǎn)接純化并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 對煙草致病性測定

將菌落在NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)36h，刮下菌苔配成菌懸液（濃度3×108cfu／mL），從煙葉背面將菌液注射到6～8葉齡活體煙草的葉肉組織中，室內(nèi)套袋保濕，以注射滅菌水為對照，觀察有無枯斑反應(yīng)。

1.5 不同品種當(dāng)歸致病性測定

離體接種：選取健壯無損傷的二年生植株，3個品種為：‘岷歸1號’（主栽品種）、‘岷歸2號’（新繁品種）和‘朝鮮當(dāng)歸 ’（引進(jìn)品種），每個品種選5株，流水沖洗干凈，乙醇表面消毒。參考方中達(dá)的注射法接種，在植株根莖交界部位注射菌懸液（濃度3×108cfu／mL），每個品種重復(fù)3次，共15株，以接種無菌水為對照。接種后將植株放在培養(yǎng)皿內(nèi)，置于28℃恒溫箱保濕，觀察發(fā)病情況。

盆栽接種：分別將3個品種的二年生歸根沖洗干凈，栽于裝有滅菌蛭石的育苗盒中，每盒栽2株，待植株長至8～10cm，在根莖交界處用注射法進(jìn)行接種，每株注射0.5mL菌懸液（濃度3×108cfu／mL），每個品種接3盒，共6株，室內(nèi)套袋保濕，觀察發(fā)病情況。

1.6 病原菌形態(tài)鑒定

參照方中達(dá)的方法，在NA、KB平板上分別劃線培養(yǎng)，觀察菌落生長速度、菌落形態(tài)和產(chǎn)生色素的情況。采用革蘭氏染色法染色，在油鏡下測量和觀察菌體的大小和形狀。生理生化指標(biāo)的測定參考《植 病 研 究 方 法 》［7］、《伯 杰 細(xì) 菌 鑒 定 手 冊 （第 八版）》［8］、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［9］等書中的方法。

1.7 16SrDNA分子鑒定

將菌株在NA培養(yǎng)基上連續(xù)活化2～3代，挑取單菌落轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，28℃、200r／min培養(yǎng)24h。8000r／min離心5min，棄去上清液，加0.85mol NaCl，12000r／min離心5min，棄上清，沉淀用于DNA提取。

基因組DNA提取采用CTAB法［10］。選擇細(xì)菌16SrDNA通用引物27f和1492r（由上?；瞪锕竞铣桑?，其序列分別為：5′－AGAGTTTGATCATGGCTCAG－3′和 5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′。PCR擴增采用50μL反應(yīng)體系，其中10×PCR Buffer 5μL，25nmol／L MgCl28μL，10nmol／L dNTPs 4μL，10nmol／L 引物27f和引物1492r各1μL，1.5UTaq酶0.5μL，DNA模板2μL，加ddH2O至50μL。PCR擴增條件為：94℃ 預(yù)變性4min；然后94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，反應(yīng)共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。4℃ 終止反應(yīng)，保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行測序。將測序得到的結(jié)果在NCBI上用Blast進(jìn)行相似性比對分析，用Mega5.1軟件對所測基因序列與GenBank中相似性最高的基因序列進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 當(dāng)歸水爛病發(fā)病癥狀

在田間，病原菌從當(dāng)歸根莖交界處開始侵染。發(fā)病初期，葉柄基部呈現(xiàn)水漬狀，植株地上部長勢良好，葉片不萎蔫；發(fā)病中期，葉柄基部開始腐爛，葉片萎蔫，整個植株呈枯萎狀；末期，地上部全部枯死，同時造成地下根腐爛。將分離純化的菌株定名為ZB1。

2.2 對煙草的致病性

ZB1菌株在煙草葉片上經(jīng)24～36h顯癥，產(chǎn)生灰褐色枯斑（圖1a），表明該菌株對煙草具有致病性。

2.3 對不同當(dāng)歸品種的致病性

ZB1離體接種試驗表明，3個品種都表現(xiàn)不同程度的濕腐。‘岷歸2號’（新繁品種）24h顯癥，接種部位出現(xiàn)明顯的水漬狀濕腐（圖1b），發(fā)病率為86.7%；‘岷歸1號’（主栽品種）48h左右顯癥，病組織黑褐色腐爛，發(fā)病率為40%；‘朝鮮當(dāng)歸’（引進(jìn)品種）發(fā)病較輕，接種部位出現(xiàn)輕微的水漬狀褐斑，發(fā)病率為13.3%。

盆栽試驗表明，接種5d，‘岷歸2號’（新繁品種）開始顯癥，葉片萎蔫，接種部位有明顯的濕腐，7d植株地上部全部枯萎，地下根開始腐爛（圖1c）；‘岷歸1號’（主栽品種）接種7d開始顯癥，發(fā)病癥狀跟田間初期癥狀一樣；‘朝鮮當(dāng)歸’（引進(jìn)品種）接種12d顯示輕微的癥狀。將枯萎的植株進(jìn)行再次劃線分離，得到的菌落和原來的菌落形態(tài)一樣，符合柯赫氏法則。

圖1 ZB1菌株致病性測定Fig.1 Pathogenicity tests of the strain ZB1

2.4 病原菌形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀

菌落在NA培養(yǎng)基上不透明，4～5d菌落略顯黃色，中間形成雪花狀白色小點且向內(nèi)凹陷。在KB培養(yǎng)基上生長快，菌落透明，產(chǎn)生可擴散性黃綠色熒光色素。菌體桿狀，大小（0.7～0.8）μm×（2.3～2.8）μm，革蘭氏染色陰性（圖2）。

圖2 菌株ZB1形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Morphological characteristics and Gram－staining of the strain ZB1

2.5 生理生化特性

該菌最適生長溫度為25～30℃，具有運動性，不耐鹽，能溶解于3%的KOH溶液，紫外燈下產(chǎn)生黃綠色熒光，嚴(yán)格好氧，水解淀粉，硝酸鹽還原陰性，接觸酶反應(yīng)陽性，可利用葡萄糖、麥芽糖、肌醇、D－甘露糖、甘油等碳素化合物，不能利用L－山梨糖。以上測試項均符合熒光假單胞桿菌的生理生化特性。

2.6 16SrDNA序列測定及同源性比較

對菌株的16SrDNA進(jìn)行測序，得到的片段大小為1445bp。測序后，將菌株的16SrDNA區(qū)域序列與GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Nucleotide Blast序列比對，結(jié)果表明，該菌株與GenBank已報道的熒光假單胞桿菌［Pseudomonas fluorescens（Trer.）Migula］AF336352.1序列相似性達(dá)99%。

用Clustal X軟件對所測的菌株序列進(jìn)行校正，將GenBank上獲得的數(shù)據(jù)載入Mega5.1軟件，按照N－J法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從構(gòu)建的發(fā)育樹可以看出，ZB1菌株與假單胞桿菌屬的菌株相似性較高，和熒光假單胞桿菌（P.fluorescens）在同一分支，聚為一類（圖3）。結(jié)合16SrDNA分子生物學(xué)特性及致病性特點，將菌株定為熒光假單胞桿菌第2生物型（P.fluorescens生物型Ⅱ）。

圖3 菌株ZB1的16SrDNA序列聚類分析樹Fig.3 Cladogram of the strain ZB1based on 16SrDNA sequences

3 討論

當(dāng)歸“水爛病”在1990年就有學(xué)者提出，其癥狀與其他當(dāng)歸病害有所不同，本文首次對引起該病害的病原進(jìn)行報道，在病組織中只分離到了細(xì)菌沒有發(fā)現(xiàn)真菌。細(xì)菌病原的鑒定是細(xì)菌病害研究的基礎(chǔ)，明確病害的病原是制定有效防治措施的重要前提。細(xì)菌分類鑒定除傳統(tǒng)的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生理生化特征和免疫學(xué)反應(yīng)等方法外，16SrDNA技術(shù)已被用于細(xì)菌的快速分子診斷和分類鑒定。國內(nèi)外一些學(xué)者利用16SrDNA方法對一些細(xì)菌進(jìn)行了研究，劉長遠(yuǎn)［11］等采用16SrDNA方法鑒定出了黃瓜細(xì)菌性白枯病病原為綠黃假單胞菌（P.viridiflava）。李守萍［12］等利用16SrDNA鑒定出油松內(nèi)菌根促生細(xì)菌為熒光假單胞桿菌（P.fluorescens），彭帥［13］等通過16SrDNA序列分析鑒定出了產(chǎn)葡萄糖酸的熒光假單胞桿菌（P.fluorescens），鄧剛［14］等采用16SrDNA鑒定了甘肅番茄細(xì)菌性斑點病病原為丁香假單胞桿菌番茄致病變種（P.syringae pv.tomato）。本試驗通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16SrDNA分子特征鑒定出了甘肅省當(dāng)歸水爛病病原為熒光假單胞桿菌 （P.fluorescens）。根據(jù)國內(nèi)外一些學(xué)者的報道，熒光假單胞桿菌是一類廣泛分布于植物根際的促生細(xì)菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR），分泌的各種次生代謝產(chǎn)物能防治一些植物病害［15－17］，如小麥全蝕病［Gaeuman－nomyces graminis （Sacc.）Arx et Olivier］、馬鈴薯軟腐?。‥rwinia carotovora）、番茄灰霉?。˙otrytis cinerea Pers.ex Tr.）等。根據(jù)資料的報道，熒光假單胞桿菌5個生物型中植物病原菌只有生物Ⅱ型［8，18］。5個生物型的分子鑒定比較復(fù)雜，本文對該病原菌只進(jìn)行了16SrDNA測序分析，其他分子生物學(xué)特性尚待進(jìn)行更深入的研究，暫時將該病原菌定為熒光假單胞桿菌第2生物型（P.fluorescens生物型Ⅱ）。本文首次報道了熒光假單胞桿菌第2生物型能引起當(dāng)歸水爛病，當(dāng)歸是該病原菌的一個新寄主。

致病性測定結(jié)果表明，該菌株對3個當(dāng)歸品種均致病，但對不同品種致病力不同，其中對‘岷歸2號’（新繁品種）致病力最強，‘岷歸1號’（主栽品種）次之，對‘朝鮮當(dāng)歸’（引進(jìn)品種）致病力最弱，說明當(dāng)歸的不同品種可能存在抗性分化。從病害控制的角度考慮，新品種‘岷歸2號’的推廣應(yīng)當(dāng)慎重。

［1］ 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典一部［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：124.

［2］ 丁永輝.甘肅地道藥材的歷史與現(xiàn)狀［J］.中藥材，1992，15（5）：38－39.

［3］ 馬象震，苗曉春.當(dāng)歸麻口病的發(fā)生及其綜合防治［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2008（11）：53－54.

［4］ 王艷，陳秀榮，王引權(quán)，等.甘肅省當(dāng)歸褐斑病菌生物學(xué)特性及其營養(yǎng)利用研究［J］.中藥材，2009，32（4）：479－482.

［5］ 趙振玲，張金渝，張智慧，等.云南當(dāng)歸軟腐病的危害性及病原鑒定［J］.云南大學(xué)學(xué)報，2010，32（2）：227－232.

［6］ 王玉娟，盛秀蘭，孫政，等.當(dāng)歸麻口病發(fā)生規(guī)律及防治研究（二）［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，1990（5）：22－24.

［7］ 方中達(dá).植病研究方法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［8］ 布坎南R E，吉本斯 N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，1984：274－312.

［9］ 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［10］奧斯伯F.精編分子生物學(xué)指南［M］.顏子穎，王海林，譯.北京：科學(xué)出版社，2001：39.

［11］劉長遠(yuǎn)，趙奎華，傅俊范，等.黃瓜細(xì)菌性白枯病CU－PV 07菌株鑒定及16SrDNA序列分析［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，39（6）：682－685.

［12］李守萍，程玉娥，唐明，等.油松菌根促生細(xì)菌—熒光假單胞桿菌的 分 離 與 鑒 定 ［J］. 西 北 植 物 學(xué) 報，2009，29（10）：2103－2108.

［13］彭帥，韓曉日，馬曉穎，等.產(chǎn)葡萄糖酸熒光假單胞桿菌的分離鑒定及解磷作用［J］.生物技術(shù)通報，2011（5）：138－141.

［14］鄧剛，屈星，陳秀蓉，等.甘肅番茄細(xì)菌性斑點病病原菌鑒定［J］.植物保護(hù)，2008，34（5）：47－51.

［15］Defago G，Haas D.Pseudomonads as antagonist of soilborne plant pathogens：modes of action and genetic analysis［J］.Soil Biochemistry，1990，6：249－291.

［16］Keel C，Schnider U，Maurhofer M，et al.Suppression of root diseases by Pseudomonas fluorescens CHA0：importance of the bacterial secondary metabolite2，4－diacetylphloroglucinol［J］.Molecular Plant－Microbe Interactions，1992，5（1）：4－13.

［17］Ursula Schnider，Christoph Keel，Caroline Blumer，et al.Amplification of the housekeeping sigma factor in Pseudomonas fluorescens CHAO enhance antibiotic production and improves biocontrol abilities l［J］.Journal of Bacteriology，1995，9：5387－5392.

［18］王金生.植物病原細(xì)菌學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.