楊成德， 陳秀蓉＊， 姜紅霞， 薛 莉， 蒲崇建， 張正偉

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070；2.甘肅省植保植檢站，蘭州 730020）

馬鈴薯（Solanum tuberosumLinn.）的種植幾乎遍及全球，一方面解決了糧食短缺問題，另一方面也帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，馬鈴薯總產(chǎn)量在全世界所有糧食作物中位于第四，國內(nèi)內(nèi)蒙古、東北三省及甘肅等地區(qū)均有大面積種植。新鮮馬鈴薯中含有淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和粗纖維，且含有禾谷類糧食所沒有的胡蘿卜素和抗壞血酸等，可作主食，也可作為蔬菜、釀造酒或作為飼料。甘肅省87個縣（市、區(qū)）中有60個縣種植馬鈴薯，甘肅定西有著“馬鈴薯之鄉(xiāng)”之稱，馬鈴薯是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)來源，也是該地區(qū)發(fā)展經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。但是，近年來馬鈴薯在生產(chǎn)及儲藏過程中炭疽病發(fā)生日趨嚴(yán)重，已成為甘肅省馬鈴薯生產(chǎn)及儲藏中的主要病害之一，嚴(yán)重影響其儲藏時間和品質(zhì)［1］。馬鈴薯炭疽病的研究可以追溯到20世紀(jì)初，目前該病廣泛分布于美國、日本和加拿大等50多個國家和地區(qū)［2］。該菌可以侵染馬鈴薯的各個生長部位［3］，侵染根部引起根腐爛，侵染維管束造成萎蔫，嚴(yán)重時引起植株枯萎［1］。據(jù)Tsror等［4］報道，該病害可使產(chǎn)量減少22%～30%，且塊莖品質(zhì)也大受影響。據(jù)調(diào)查，馬鈴薯炭疽病在甘肅省武都、天祝和定西等地發(fā)生較重，楊成德等［1］對該病害的癥狀、病原及室內(nèi)毒力測定結(jié)果進(jìn)行了報道，但有關(guān)病原菌生物學(xué)特性及營養(yǎng)利用能力等方面的研究未見報道。因此，作者對該病原菌的生物學(xué)特性和營養(yǎng)利用（碳源、氮源）能力等進(jìn)行了研究，以期為掌握該病害的發(fā)生規(guī)律和制定綜合防治措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌種：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實驗室保存的馬鈴薯炭 疽 病 菌 ［Colletotrichum coccodes （Wallr.）Hughes］。

培養(yǎng)基：選用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA培養(yǎng)基）、虎紅瓊脂培養(yǎng)基、燕麥片培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、査理固體培養(yǎng)基、查彼固體培養(yǎng)基、麥芽糖培養(yǎng)基、麥芽瓊脂培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基，參考文獻(xiàn)［5］進(jìn)行配制。

1.2 方法

1.2.1 生物學(xué)特性研究

1.2.1.1 溫度對菌絲生長的影響

采用生長速率法。將病原菌接種于PDA平板中央，分別置于溫度為5、10、15、20、25、30、35和40℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3次重復(fù)，3d后每隔1d用十字交叉法測定菌落直徑并描述菌落形態(tài)特征，直至生長最快溫度下滿皿。

1.2.1.2 溫度、濕度和pH對分生孢子萌發(fā)的影響

具體方法參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行，即在干燥器內(nèi)用硫酸法控制濕度，將孢子粉撒于載玻片上，設(shè)置相對濕度99%、95%、90%、85%和液態(tài)水5個處理，室溫下培養(yǎng)24h后挑取各處理的孢子，無菌水制片，立即檢查孢子萌發(fā)率，3次重復(fù)，鏡檢不少于10個視野，100個孢子，并計算孢子萌發(fā)率。

1.2.1.3 浸提液對孢子萌發(fā)的影響

配制各種浸提液（土壤浸提液，馬鈴薯幼苗期根、莖、葉浸提液，薯塊浸提液，其中水∶浸提液＝1∶10）懸滴法測定孢子萌發(fā)率，其他同1.2.1.2。

1.2.1.4 光照對孢子萌發(fā)的影響

用無菌水配制孢子懸浮液，懸滴法制片，置于全光照和全黑暗條件下處理，其他同1.2.1.2。

1.2.2 培養(yǎng)性狀研究

1.2.2.1 碳源和氮源對菌絲生長的影響

采用生長速率法，即將PDA平板上活化后的病原菌用直徑0.4cm的打孔器取菌餅，取1塊置于加1.5%不同碳源或加0.25%不同氮源的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中央，最適溫度下培養(yǎng)，3d后每隔1d用十字交叉法測定菌落直徑并描述菌落特征，直至生長最快碳源或氮源滿皿。具體碳源和氮源種類分別見圖7和圖9，以不加任何碳源或氮源的培養(yǎng)基為對照，具體方法參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。

1.2.2.2 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

采用生長速率法。將經(jīng)PDA平板活化的病原菌用0.4cm直徑的打孔器切取菌餅，取1塊置于10種培養(yǎng)基（具體培養(yǎng)基種類見圖9）中央，其他同1.2.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)特性研究

2.1.1 溫度對菌絲生長的影響

馬鈴薯炭疽病菌在5～40℃范圍內(nèi)均可生長，小于15℃和高于35℃時菌絲生長緩慢，25～35℃為較適宜溫度范圍，其菌落直徑顯著高于其他生長溫度（P＜0.05），30℃為最適生長溫度（圖1），此時在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d菌落直徑為7.58cm，且有大量分生孢子盤形成，菌落質(zhì)地均勻，表面有不明顯輪紋，無色素產(chǎn)生，無特殊氣味，菌落邊緣整齊且著生絮狀菌絲，偶有扇形突變。

圖1 溫度對馬鈴薯炭疽病菌菌絲生長的影響Fig.1 Effects of temperature on colony growth of C.coccodes

2.1.2 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響

分生孢子在5～40℃內(nèi)均可萌發(fā)，20～30℃萌發(fā)率較高，25℃為最適萌發(fā)溫度，萌發(fā)率顯著高于其他溫度（P＜0.05），在溫度低于5℃和高于40℃時分生孢子不萌發(fā)，在5～25℃條件下，隨溫度升高，孢子萌發(fā)率隨之增大，當(dāng)溫度高于25℃時，孢子萌發(fā)率隨溫度升高而呈現(xiàn)顯著下降趨勢（圖2）。

圖2 溫度對馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of temperature on conidial germination of C.coccodes

2.1.3 濕度對分生孢子萌發(fā)的影響

分生孢子在液態(tài)水中萌發(fā)率最高，達(dá)93.33%，顯著高于其他濕度條件（P＜0.05），在相對濕度99%時萌發(fā)率為18.95%，相對濕度為85%時萌發(fā)率僅為8.00%，即隨著相對濕度的下降孢子萌發(fā)率也顯著下降，該結(jié)果說明高濕度是該分生孢子萌發(fā)的必要條件，且液態(tài)水為該分生孢子萌發(fā)的最適濕度條件（圖3）。

圖3 濕度對馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.3 Effects of relative humidity on conidial germination of C.coccodes

2.1.4 pH對分生孢子萌發(fā)的影響

分生孢子在供試的pH范圍內(nèi)均可萌發(fā)，但在pH6.47～7.38范圍內(nèi)較高，且在pH6.7時其萌發(fā)率顯著高于其他pH條件（P＜0.05），說明pH對該分生孢子萌發(fā)影響明顯，但中性較適合該孢子萌發(fā)（圖4）。

圖4 pH對馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.4 Effects of pH value on conidial germination of C.coccodes

2.1.5 浸提液對分生孢子萌發(fā)的影響

分生孢子在薯塊浸提液中萌發(fā)率顯著高于葉、莖、根或土壤浸提液（P＜0.05），根浸提液萌發(fā)率顯著低于其他浸提液（P＜0.05）（圖5）。該結(jié)果說明薯塊中的化學(xué)物質(zhì)對孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用，分生孢子在薯塊上容易萌發(fā)，而根較其他器官則不利于分生孢子的萌發(fā)。

圖5 營養(yǎng)液對馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.5 Effects of the extracts on conidial germination of C.coccodes

2.1.6 光照對孢子萌發(fā)的影響

在全光照條件下分生孢子萌發(fā)率略高于全黑暗條件，但差異不顯著（圖6），表明該分生孢子萌發(fā)對光不敏感，在有無光照條件下均能萌發(fā)。

圖6 光照對馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.6 Effects of light on conidial germination of C.coccodes

2.2 培養(yǎng)性狀研究

2.2.1 碳源對菌絲生長的影響

馬鈴薯炭疽菌對各種碳源均有較好的利用能力，菌絲生長良好，除D－阿拉伯糖和氯醛糖外菌落直徑均顯著高于對照（P＜0.05），對菌絲生長有明顯促進(jìn)作用，但以氯醛糖為碳源時菌落直徑顯著小于對照（P＜0.05），對菌絲生長有抑制作用。該結(jié)果說明此菌對碳源要求不嚴(yán)格，能利用多種碳源，但利用能力有差異，利用能力高低依次為蔗糖＞葡萄糖＞甘露糖＞D－木糖＞麥芽糖＞D－半乳糖＞乳糖＞D－果糖＞可溶性淀粉＞D－阿拉伯糖＞氯醛糖。

圖7 碳源對馬鈴薯炭疽病菌菌絲生長的影響Fig.7 Effects of carbon sources on colony growth of C.coccodes

2.2.2 不同碳源培養(yǎng)基上菌落特征

馬鈴薯炭疽病菌在葡萄糖培養(yǎng)基上菌落黑褐色，輪紋明顯，表面平鋪，質(zhì)密，邊緣整齊，菌絲絮狀，無特殊氣味和色素產(chǎn)生（圖8a）；在D－阿拉伯糖和D－半乳糖培養(yǎng)基上菌絲茂密，產(chǎn)生淡褐色非水溶性色素，邊緣不整齊，呈折扇狀（圖8b）。在乳糖培養(yǎng)基上菌體質(zhì)密，菌絲發(fā)達(dá)，分生孢子盤及產(chǎn)孢量大，菌落表面光滑；在D－果糖培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯，顏色較深，分生孢子盤呈放射狀排列，無色素，無特殊氣味產(chǎn)生（圖8c）；在其余碳源培養(yǎng)基上菌落形態(tài)與葡萄糖培養(yǎng)基上基本相似。在對照培養(yǎng)基上分生孢子盤小且密生，菌落顏色淺，菌絲絮狀發(fā)達(dá)，表面光滑。

2.2.3 氮源對菌絲生長的影響

硝酸銨對炭疽菌生長有顯著促進(jìn)作用（P＜0.05），在以氯化銨為氮源的培養(yǎng)基上炭疽菌生長較對照快，但差異不顯著（P＞0.05），其他供試氮源均不利于該菌生長，且在碳酸銨、L－谷氨酸、尿素、大豆蛋白胨、L－組氨酸、L－精氨酸、亮氨酸、蛋白胨和甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基上差異顯著（P＜0.05）（圖9）。該結(jié)果說明馬鈴薯炭疽病菌可以利用多種氮源，但對不同氮源的利用能力有差異。

圖8 碳源培養(yǎng)基上馬鈴薯炭疽病菌菌落特征Fig.8 The colony characteristics of C.coccodes on C－source media

2.2.4 氮源培養(yǎng)基上的菌落特征

在對照培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯，菌絲生長旺盛，菌落顏色深，表面光滑，邊緣整齊，無色素產(chǎn)生，分生孢子盤小且密，產(chǎn)孢量大；在硝酸鈉、L－組氨酸、L－精氨酸、亮氨酸和L－谷氨酸培養(yǎng)基上輪紋不明顯，菌絲生長旺盛，菌落表面光滑，產(chǎn)孢量較大（圖10a）；在氯化銨、硝酸銨、碳酸銨和尿素培養(yǎng)基上菌絲發(fā)達(dá)呈絮狀，分生孢子盤小而密，無色素產(chǎn)生，有特殊氣味，分生孢子盤大，產(chǎn)孢量大，但在尿素培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯，而其他氮源培養(yǎng)基上輪紋不明顯；在大豆蛋白胨培養(yǎng)基上菌落顏色深，菌絲發(fā)達(dá)呈絮狀，分生孢子盤小而密，無色素產(chǎn)生，有特殊氣味，產(chǎn)孢量大（圖10b）；在蛋白胨培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯呈深淺相間的同心圓，菌絲發(fā)達(dá)呈絮狀，分生孢子盤小而密，無色素產(chǎn)生，有特殊氣味，產(chǎn)孢量大；在甘氨酸培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯呈兩個同心圓狀，邊緣菌絲顏色淡，中央顏色深，分生孢子盤小而密，無色素產(chǎn)生，有特殊氣味，產(chǎn)孢量大（圖10c）。

圖9 氮源對馬鈴薯炭疽病菌菌絲生長的影響Fig.9 Effects of N－source on colony growth of C.coccodes

圖10 氮源培養(yǎng)基上馬鈴薯炭疽病菌菌落特征Fig.10 The colony characteristics of C.coccodes on N－source media

2.2.5 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

馬鈴薯炭疽菌在PDA和麥芽汁培養(yǎng)基上菌落直徑顯著高于其他培養(yǎng)基（P＜0.05），而在玉米粉及水瓊脂上顯著小于其他培養(yǎng)基（P＜0.05）。該菌在馬丁氏培養(yǎng)基上菌落邊緣整齊，表面光滑，菌絲發(fā)達(dá)，菌落中央顏色略深，邊緣較淡，分生孢子盤少；玉米粉培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯，表面粗糙，有淡褐色水溶性色素產(chǎn)生；麥芽糖和麥芽汁培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯，無特殊氣味，有淡褐色水溶性色素產(chǎn)生，菌絲發(fā)達(dá)，有較多分生孢子盤形成（圖12a）；燕麥片和查彼培養(yǎng)基上菌落輪紋不明顯，表面光滑，無色素產(chǎn)生，有無色氣生菌絲產(chǎn)生，菌落近透明，有較多分生孢子盤形成（圖12b）；查理培養(yǎng)基上菌落輪紋不明顯，表面粗糙，有橘紅色非水溶性色素產(chǎn)生，無分生孢子盤產(chǎn)生（圖12c）；PDA和PSA培養(yǎng)基上菌絲顏色淡，無同心輪紋，無色素產(chǎn)生，有無色氣生菌絲產(chǎn)生，菌落近透明，有較多分生孢子盤形成；水瓊脂培養(yǎng)基上菌落輪紋不明顯，表面光滑，邊緣整齊，無色素產(chǎn)生，氣生菌絲少，菌落近透明，分生孢子盤少。

圖11 培養(yǎng)基對馬鈴薯炭疽病菌菌絲生長的影響Fig.11 Effects of medium on colony growth of C.coccodes

圖12 不同培養(yǎng)基上的馬鈴薯炭疽病菌菌落特征Fig.12 The colony characteristics of C.coccodes on different media

3 討論與結(jié)論

已研究報道的馬鈴薯病害有幾十種［8］，但報道較多的是馬鈴薯晚疫病、病毒?。≒VX和PVY）、軟腐病、環(huán)腐病和黑脛病等在生產(chǎn)中較常見的病害，對這些病害的病原學(xué)、發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)等均有較系統(tǒng)的 研 究［9－11］。 許 多 研 究 者［12－13］認(rèn) 為，生 長 期 病原菌危害薯塊，造成薯塊帶菌或潛伏侵染后，在貯藏期條件適宜時引起薯塊腐爛，如馬鈴薯塊莖干腐病、馬鈴薯晚疫病和馬鈴薯環(huán)腐病等薯塊帶菌均可引起貯藏期薯塊腐爛。馬鈴薯炭疽病也為生長期和貯藏期均發(fā)生的重要病害之一，但國內(nèi)文獻(xiàn)較少。因此，本試驗研究了該病原菌的生物學(xué)特性，結(jié)果表明，該病原菌菌絲在20～30℃生長較快，30℃為最適生長溫度，與文獻(xiàn)［14］報道一致；該菌分生孢子最適萌發(fā)溫度為25℃，5℃時分生孢子不萌發(fā)，與文獻(xiàn)報道［14］一致；分生孢子在液態(tài)水中萌發(fā)率最高，達(dá)93.33%，隨著相對濕度下降萌發(fā)率也下降，說明高濕有利于分生孢子萌發(fā)；分生孢子在pH6.7時萌發(fā)率最高，與文獻(xiàn)報道一致［14］；分生孢子萌發(fā)對光不敏感，在有、無光照條件下都能萌發(fā)。在薯塊浸提液中萌發(fā)率最高，而在根、莖、葉浸提液中萌發(fā)率很低，此可能由于本試驗所選用的是馬鈴薯幼苗期根、莖和葉，是否幼苗期根、莖和葉比成熟期抗病還需進(jìn)一步研究。該病原菌可以廣泛利用碳、氮源，并且在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)、產(chǎn)孢能力及生長速率不同，說明該菌對不同營養(yǎng)的利用能力有差異，這些差異能否用來對該菌進(jìn)行分類或在病害綜合防治中應(yīng)用還須進(jìn)一步研究。本試驗較詳細(xì)地報道了馬鈴薯炭疽病菌的生物學(xué)特性及對不同碳、氮源的利用能力等，可為了解該病害的發(fā)生規(guī)律及制定綜合控制措施提供依據(jù)。

［1］ 楊成德，姜紅霞，陳秀蓉，等.甘肅省馬鈴薯炭疽病的鑒定及室內(nèi)藥劑篩選［J］.植物保護(hù)，2012，38（6）：127－133.

［2］ Johnson D A，Miliczky E R.Distribution and development of blackdot，Verticilliumwilt，and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State［J］.Plant Disease，1993，77：74－79.

［3］ Pavlista A，Kerr E D.Black dot of potato caused by Colletotrichum coccodesin Nebraska［J］.Plant Disease，1992，76：1077.

［4］ Leah Tsror（Lahkim），Orly Erlich，Marina Hazanovsky.Effect of Colletotrichum coccodes on potato yield tuber quality，and stem colonization during spring and autumn［J］.Plant Disease，1999，83：561－565.

［5］ 方中達(dá).植病研究方法［M］.第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：122－154.

［6］ 楊成德，陳秀蓉，薛莉，等.牧草根際狗牙根平臍蠕孢菌的研究［J］.草業(yè)學(xué)報，2008，17（3）：86－92.

［7］ 陳秀蓉，南志標(biāo)，楊成德，等.牧草根際3種平臍蠕孢菌培養(yǎng)性狀及對營養(yǎng)的利用能力［J］.草業(yè)學(xué)報，2005，14（5）：99－104.

［8］ 王桂霞.馬鈴薯病毒病的防治［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（6）：25－30.

［9］ 王合松，王培紅.馬鈴薯主要病害的發(fā)生與防治對策［J］.農(nóng)資科技，2004（1）：40－46.

［10］馬宏.我國馬鈴薯軟腐病防治的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報，2007（1）：76－80.

［11］魏周全，宗世忠，張廷義.定西市馬鈴薯病害調(diào)查［J］.中國馬鈴薯，2005，19（2）：124－126.

［12］Henson J M，F(xiàn)rench R C.The polymerase chain reaction and plant disease diagnosis［J］.Annual Review Phytopathology，1993，31：81－109.

［13］劉會梅，王向軍，封立平.馬鈴薯炭疽病研究進(jìn)展［J］.植物檢疫，2007，21（1）：38－41.

［14］Dillard H R.Influence of temperature，pH，osmotic potential，and fungicide sensitivity on germination of conidia and growth form sclerotia of Colletotrichum coccodes in vitro［J］.Phytopathology，1988，78：1357－1361.