邱 芬，趙 根

(1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310058;2.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313000)

月季 (Rosa hybrida)被譽(yù)為花中皇后［1－2］，采后生理及貯藏保鮮技術(shù)的研究對(duì)其鮮切花生產(chǎn)和采后生理理論研究具有重要意義。薛秋華等［3］研究了薩蔓莎切花衰老過程中超氧化歧化酶 (SOD)活性的變化，為延緩月季衰老提供依據(jù)。SOD是活性氧清除反應(yīng)過程中第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶，在抗氧化酶類中處于核心地位。研究表明，噴施低濃度SNP(sodium nitroprusside，硝普鈉)可有效提高南方紅豆杉幼苗SOD活性［4］。NaCl脅迫下添加外源NO提高了燕麥幼苗的株高和SOD活性［5］。王松華等［6］研究發(fā)現(xiàn)，外源 NO 對(duì) Ni毒害有緩解作用。還有研究表明，100 μmol·L－1Ni處理能使小麥幼苗 SOD等抗氧化酶活性升高［7－8］。本試驗(yàn)將以SNP為外源NO供體對(duì)月季采后SOD活性影響展開研究。SNP是目前常用的NO供體。通過試驗(yàn)觀察SNP處理后鮮切花月季中的SOD活性的變化，從而分析外源NO對(duì)月季SOD活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為月季品種薩蔓莎。訂購60枝未經(jīng)過任何處理的切花，直接干儲(chǔ)運(yùn)回試驗(yàn)室供用。選擇含苞待放，花枝大小形態(tài)基本一致的健壯花枝39枝作為試驗(yàn)材料。

1.2 主要儀器及試劑

主要儀器。UV-2550紫外可見分光光度計(jì)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (杭州達(dá)科，吉西今科學(xué)儀器有限公司)，F(xiàn)A1104型電子天平 (上海衡平儀器儀表廠)，移液槍等。

儲(chǔ)備液A。稱取15.6 g NaH2PO4·2H2O于燒杯中用蒸餾水溶解，移入500 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。

儲(chǔ)備液B。稱取35.85 g Na2HPO4·12 H2O于燒杯中用蒸餾水溶解，移入500 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。

分別取上述A液8.5 mL和B液91.5 mL，用300 mL蒸餾水充分混勻后即為0.05 mol·L－1磷酸緩沖液 (pH值7.8，含0.1 mmol·L－1EDTA)。

NBT(氯化硝基四氮唑藍(lán))反應(yīng)液。稱取0.012 04 g核黃素溶于100 mL蒸餾水中，取4 mL，稱取0.387 g甲硫氨酸，0.010 3 g NBT，加入磷酸鹽緩沖液 (pH值7.8)196 mL溶解。

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 瓶插處理

以100 μmol·L－1SNP為NO的供體。試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，保持溫度、光照等因素相同，在系統(tǒng)誤差之內(nèi)。觀察月季切花在單一因素 (SNP處理)下的SOD活性變化情況。以蒸餾水為對(duì)照組。

1.3.2 瓶插預(yù)處理

將運(yùn)回試驗(yàn)室的花材去除多余葉片，留取花梗30±2 cm，由基部45°剪后即插入蒸餾水中，使花梗基部浸入水中3 cm左右，恢復(fù)24 d(誤差0.5 h)，使其充分吸水。經(jīng)過預(yù)處理，挑取健壯、開放程度基本一致的月季切花共39枝，挑出3枝作試驗(yàn)樣品，待測，記為第0天，其余36支分為對(duì)照 (CK)和處理 (T)2組，重復(fù)3次。其中對(duì)照組以蒸餾水為瓶插液，處理組用100 μmol·L－1SNP為瓶插液，將其置于常溫、漫射光試驗(yàn)臺(tái)上，每日觀察記錄。

對(duì)照組 (CK)。將其中18枝平均放入3個(gè)盛有等量蒸餾水的瓶中，每瓶6枝，編號(hào)分別為CK1，CK2和 CK3。

處理組。將另外18枝平均放入3個(gè)盛有等量100 μmol·L－1SNP的瓶中，每瓶6枝，編號(hào)分別為 T1，T2，T3。

1.3.3 測定時(shí)間段

根據(jù)開花級(jí)數(shù)通行標(biāo)準(zhǔn)，從蕾期至萎蔫劃分為6級(jí):0級(jí)，花萼抱合直立;1級(jí)，花萼開展至水平;2級(jí)，花瓣開始松散;3級(jí)，花瓣初開，外層花瓣展開;4級(jí)，盛開，多層花瓣展開;5級(jí)，盛末，花瓣全開花朵露心;6級(jí)，蔫初，花瓣翻卷或萎蔫。在第0天 (2～3級(jí))、切花達(dá)到盛花期(3～4級(jí)，第3天)、開始衰敗期 (5級(jí)，第9天)、失去觀賞價(jià)值期 (6級(jí)，第13天)各取樣1次。

1.3.4 測定指標(biāo)

SOD活性。測定部位為花瓣、花萼、花梗。

在每個(gè)時(shí)間段測定時(shí)，從3個(gè)對(duì)照瓶中各取1枝，分別測定3個(gè)部位的上述指標(biāo)，記錄數(shù)據(jù)。處理瓶測定方法同上。

1.4 月季SOD提取液的制備

取樣部位為花瓣、花萼、花梗，各部位樣品分別取0.6 g(精確到0.01 g)。為減小系統(tǒng)誤差，花瓣取樣采用先去除最外層花瓣，然后將剩余花瓣剪碎混勻稱取樣品;花萼同花瓣的取樣方法;花梗取的是距花托5～10 cm莖段，剪碎混勻取樣。其中邊取樣邊用液氮快速研磨，盡可能準(zhǔn)確測定試驗(yàn)指標(biāo)。在每個(gè)時(shí)間段測定時(shí)，從3個(gè)對(duì)照瓶 (CK)和3個(gè)處理瓶 (T)中，每瓶取形態(tài)相近的花材1枝，統(tǒng)一剪取花瓣、花萼、花梗，用電子天平各準(zhǔn)確稱0.6 g樣品 (精確到0.01 g)，共18份。每份提取粗酶液時(shí)，將樣品放進(jìn)冰浴預(yù)冷的研缽中，加液氮快速研磨成粉末，然后加3次pH值7.8的磷酸鹽緩沖液，每次加2 mL，再加少量2%的PVP快速碾磨成勻漿，完成后將樣品轉(zhuǎn)入到10 mL的離心管中，用2 mL磷酸緩沖液洗滌研缽，將洗液一并轉(zhuǎn)入離心管中，成對(duì)調(diào)節(jié)平衡后用冷凍離心機(jī)在4℃，12 000 g·min－1下離心20 min，上清液即為SOD提取液，將其轉(zhuǎn)入小試管中保存于4℃冰箱中備用。

1.5 紫外分光光度法測定SOD活性

1.5.1 紫外分光光度法

利用NBT法測定。取小試管18支并編號(hào)，依次加入各酶液上清液50 μL和3 mL NBT反應(yīng)液為樣品管。另取3支小試管，加入50 μL磷酸緩沖液和3 mL NBT溶液，2支用雙層黑紙?zhí)淄踩陶诠庾稣{(diào)零用，另1支作對(duì)照管，和樣品管一起在25℃下燈光照25 min(觀察顏色變化，不能太深)。測560 nm下吸光值 (D)。

1.5.2 數(shù)據(jù)處理

15 μL酶液+3 mL考馬斯亮藍(lán)，于595 nm下測月季可溶性蛋白D值。

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.290 8X+0.004 6(Y為吸光值，X為蛋白質(zhì)含量)，利用NBT光照還原紫外分光光度法將試驗(yàn)測得的月季D值代入Y，求得X。

月季可溶性蛋白質(zhì)含量:

M(mg·g－1鮮重)=X·VT·FW－1·V－11。

式中，VT為樣液總體積 (mL)，V1為測定時(shí)樣品用量 (mL)，F(xiàn)W為鮮重 (g)。

SOD活性=(DCK－Df)VT(0.5DCK·0.6M·V1)－1。

式中，DCK為照光對(duì)照管的光吸收值，Df為樣品管的光吸收值，VT為樣液總體積 (mL)，V1為測定時(shí)樣品用量 (mL)，M為1 g樣品中可溶性蛋白的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 花瓣SOD活性的變化

表1顯示，瓶插前期，第0天 (復(fù)水后第1天)對(duì)照和處理花瓣SOD活性基本一致;第3天(切花達(dá)到盛花期)測定，SOD活性跟第0天相比，數(shù)值上升很多，說明瓶插前期，SOD活性值呈逐漸上升趨勢;第6天 (開始衰敗期)測定，SOD活性值有所下降，第9天 (失去觀賞價(jià)值期)測定，SOD活性值又下降一些。說明切花瓶插第3天，處于開花最佳時(shí)期時(shí)，SOD活性達(dá)到最大，第6天和第9天花開始衰敗和失去觀賞價(jià)值，SOD活性隨之下降;在整個(gè)瓶插過程中，花瓣SOD活性呈先升后降的趨勢。經(jīng)SNP處理的月季切花花瓣的SOD活性值明顯大于對(duì)照組。

2.2 花萼SOD活性的變化

表2顯示，瓶插前期，第0天 (復(fù)水后第1天)對(duì)照和處理花托SOD活性基本一致;第3天(切花達(dá)到盛花期)測定，與第1天相比，SOD活性上升很多，說明瓶插前期，SOD活性值呈逐漸上升趨勢;第6天 (開始衰敗期)測定，SOD活性值有所下降;第9天 (失去觀賞價(jià)值期)測定，SOD活性值又下降一些。說明切花瓶插第3天，處于開花最佳時(shí)期時(shí)，SOD活性達(dá)到最大，第6天和第9天花開始衰敗和失去觀賞價(jià)值，SOD活性隨之下降。在整個(gè)瓶插過程中，花瓣SOD活性呈先升后降的趨勢。而經(jīng)過SNP處理的月季切花花萼的SOD活性值明顯大于對(duì)照組。

表1 不同時(shí)間NO對(duì)月季花瓣SOD活性的影響

表2 不同時(shí)間NO對(duì)月季花萼SOD活性的影響

2.3 花梗SOD活性的變化

表3顯示，瓶插前期，第0天 (復(fù)水后第1天)對(duì)照和處理花彎莖SOD活性基本一致;第3天 (切花達(dá)到盛花期)測定，與第1天相比，SOD活性值上升很多，說明瓶插前期，SOD活性值呈逐漸上升趨勢;第6天 (開始衰敗期)測定，SOD活性值有所下降;第9天 (失去觀賞價(jià)值期)測定，SOD活性值又下降一些。說明切花瓶插第3天，處于開花最佳時(shí)期時(shí)，SOD活性達(dá)到最大，第6天和第9天花開始衰敗和失去觀賞價(jià)值，SOD活性隨之下降。在整個(gè)瓶插過程中，花瓣SOD活性呈先升后降的趨勢。經(jīng)SNP處理的月季切花花彎莖的SOD活性值明顯大于對(duì)照組。

表3 不同時(shí)間NO對(duì)月季花梗SOD活性的影響

綜上可知，月季切花在瓶插過程中，不同部位的SOD活性值均呈先迅速上升，達(dá)到最大值后逐漸下降的趨勢。月季切花瓶插前期，SOD活性迅速增強(qiáng)，表明切花吸水量增加，清除活性氧保護(hù)酶的活性提高，提高了清除活性氧的能力。瓶插后期隨著切花的蒸騰作用超過其吸水速率，花瓣中SOD和CAT活性下降，活性氧的產(chǎn)生與清除平衡系統(tǒng)受到破壞，導(dǎo)致膜脂過氧化加劇，MDA大量積累，質(zhì)膜損傷，透性增加，造成花朵衰老，最終死亡。

試驗(yàn)顯示，處理組SOD活性值高于對(duì)照組，說明NO有增強(qiáng)SOD活性的功能。張少穎等［9］首次將NO保鮮的研究用于月季切花，并獲得了預(yù)期的效果。此外，100 μmol·L－1SNP能降低月季切花各部位的萎蔫率，說明外源NO能夠延緩月季切花的衰老，延長瓶插壽命。

3 小結(jié)和討論

試驗(yàn)通過用 100 μmol·L－1的外源 NO 供體SNP作為瓶插液對(duì)月季切花進(jìn)行處理培養(yǎng)，結(jié)果表明，不同測定時(shí)間的SOD活性均明顯高于對(duì)照組(蒸餾水處理)?？赡躈O通過某種途徑誘導(dǎo)了SOD抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)了其活性。有研究顯示，NO能誘導(dǎo)CAT和APX活性，并對(duì)CAT，SOD轉(zhuǎn)錄水平有影響［10］。100 μmol·L－1SNP 對(duì)鹽脅迫下白骨壤 (A.marina)葉片SOD活性的影響是通過非 cGMP 依賴途徑實(shí)現(xiàn)的［11］。Beligni等［10］發(fā)現(xiàn)，GA可減少大麥糊粉層中CSOD的含量，而NO可延緩GA所引起的CAT和SOD的減少。目前，適當(dāng)濃度的外源NO能提高植物抗逆性的論斷已基本上得到認(rèn)同［12］。試驗(yàn)證明，100 mol·L－1硝普鈉 (SNP)+干旱處理顯著提高了刺槐幼苗葉片的SOD 和 POD 活性［13］。劉建新等［14］研究也表明，100 μmol·L－1SNP顯著提高了幼苗葉片SOD含量。試驗(yàn)研究確定了外源NO對(duì)月季采后SOD活性的影響，得出NO能增強(qiáng)SOD活性，延緩月季切花衰老，延長采后壽命的結(jié)論，對(duì)月季切花保鮮技術(shù)研究具有重要意義。但在外源NO保鮮技術(shù)如何運(yùn)用到實(shí)際切花保鮮方面還有待進(jìn)一步探索研究，期待月季切花采后保鮮乃至其他切花保鮮道路上的重大突破。

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