田大偉 孫 巖 楊宇明 湯 洋 雷鳴德 韓瑞發(fā)

BAI-1在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)定位及與VEGF MCD P53蛋白相關(guān)性研究

田大偉 孫 巖 楊宇明 湯 洋 雷鳴德 韓瑞發(fā)

目的：探討B(tài)AI-1在不同分期腎細(xì)胞癌中的表達(dá)差異以及BAI-1抑制腫瘤血管內(nèi)皮增殖的機(jī)制。方法：取人腎細(xì)胞癌標(biāo)本133例，正常腎組織標(biāo)本133例（癌旁＞4 cm處正常腎組織，病理學(xué)檢測證實(shí)）。正常腎臟標(biāo)本為對照組，腎細(xì)胞癌標(biāo)本為研究組。采用免疫組織化學(xué)SP法分別檢測BAI-1、VEGF、MVD、P53，進(jìn)行半定量統(tǒng)計學(xué)分析。取臨床新鮮腎細(xì)胞癌組織標(biāo)本27例，癌旁4cm以外腎組織15例。應(yīng)用Western blot方法分析BAI-1腎細(xì)胞癌組織及正常腎組織中的表達(dá)差異。結(jié)果：免疫組化統(tǒng)計分析及western blot檢測顯示正常腎組織中BAI-1表達(dá)明顯高于腎細(xì)胞癌組織，并且與臨床分期相關(guān)，T1～2局限期腎細(xì)胞癌中BAI-1表達(dá)遠(yuǎn)高于T3～4進(jìn)展期腎細(xì)胞癌（P＜0.05）。同時BAI-1表達(dá)與VEGF具有相關(guān)性（r=0.586，P＜0.05），與MVD具有相關(guān)性（r=0.577，P＜0.05），與P53表達(dá)具有相關(guān)性（r=0.513，P＜0.001）。結(jié)論：在腎細(xì)胞癌組織中BAI-1含量較正常腎組織明顯降低且與腎細(xì)胞癌臨床分期相關(guān)，BAI-1表達(dá)與VEGF、MVD負(fù)相關(guān)，與P53正相關(guān)性。BAI-1可能參與了腫瘤微血管增殖的負(fù)調(diào)節(jié)，BAI-1的表達(dá)減少可能與P53的突變相關(guān)。

BAI-1 腎細(xì)胞癌 P53VEGF 靶向治療 MVD

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在泌尿系腫瘤中僅次于膀胱癌，位居第二位。2001年美國統(tǒng)計RCC的發(fā)病率比1950年上升12.6%，病死率上升36.5%，對于免疫、化學(xué)、放射治療均不理想，目前手術(shù)治療仍是其主要治療手段，中晚期腎細(xì)胞癌手術(shù)后復(fù)發(fā)率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率很高。眾所周知，腎細(xì)胞癌的特點(diǎn)是腫瘤內(nèi)血管豐富，腫瘤生長、轉(zhuǎn)移都依賴于血管的生長［1-2］。近年來針對這一特點(diǎn)，抑制腫瘤血管生長的靶向治療被越來越多的人關(guān)注。

1997年Nishimori等［3］利用人腦膠質(zhì)瘤研究具有功能的P53結(jié)合位點(diǎn)的靶基因時，分離出一種新的靶基因，其特異性表達(dá)于人的腦組織中，具有抑制血管生成的作用。因此命名為腦特異性新生血管抑制因子1（Brain-Specific Angiogenesis Inhibitor 1，BAI-1）。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)BAI-1不僅僅在腦組織中存在，結(jié)腸、胃、肺、胰腺等組織中也發(fā)現(xiàn)了BAI-1的存在［4］。BAI-1屬于G蛋白偶聯(lián)受體的分泌素受體家族，Mori等［5］通過細(xì)胞培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)BAI-1蛋白定位于細(xì)胞漿及細(xì)胞膜上，主要集中于細(xì)胞膜。有研究通過親水性分析發(fā)現(xiàn)BAI-1蛋白是一種多重跨膜蛋白，N末端包含30個氨基酸殘基的分泌型信號序列，下游有兩種功能元件：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD），可以與整合素結(jié)合，而整合素可抑制由成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的血管生成［6］；5個血小板凝血酶敏感蛋白1（thrombospondin-1，TSP-1）［7］重復(fù)序列，TSP1為多肽類內(nèi)源性新生血管抑制劑，主要通過TSRs與內(nèi)皮細(xì)胞CD36分子的相互作用來抑制由成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）誘導(dǎo)的新生血管生成［8］。因此BAI-1可能具有抗腎細(xì)胞癌血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，可成為新的抗腫瘤血管生成因子。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科2007年1月至2011年12月腎細(xì)胞癌根治術(shù)標(biāo)本133例，其中對照腎組織133例為癌旁4 cm以外腎組織（病理學(xué)證實(shí)）。新鮮腎細(xì)胞癌標(biāo)本27例，癌旁4 cm以外腎組織15例?；颊吣挲g46～82歲，平均年齡56（56.13±13.98）歲。所有患者均為初治，術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療及其他保守治療。所有腎細(xì)胞癌病例均已經(jīng)過病理證實(shí)為透明細(xì)胞癌。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片3張，采用SP法染色，一抗為兔抗人BAI-1多克隆抗體，鼠抗人P53單克隆抗體（Abcam公司），兔抗人CD34多克隆抗體、兔抗人VEGF多克隆抗體（武漢博士德公司）?？贵w稀釋比均為1：100。以正常腎組織為對照組，按TNM（AJCC，2002）分期進(jìn)行分組，分為2組：局限期腎細(xì)胞T1-2組101例，進(jìn)展期腎細(xì)胞癌T3～4組32例。

1.2.2 Western blot 收集臨床腎細(xì)胞癌根治術(shù)后標(biāo)本27例 按TNM分期分為2組：局限期T1～2組23例，進(jìn)展期T3～4組4例。癌旁＞4 cm處腎組織15例。分別檢測組織中BAI-1的蛋白含量。用液氮冰凍組織樣本提取蛋白并測定濃度。取蛋白20 μg行Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），6%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳完成后，電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%脫脂奶粉的TTBS封存PVDF膜。加一抗BAI-1兔抗人多克隆抗體（Santa Cruz，1：500），4℃過夜。加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h。雜交膜用ECL化學(xué)發(fā)光試劑于暗室中顯影并感光膠片。GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) BAI-1、VEGF、P53、MVD免疫組化結(jié)果判定方法參考牟成金等［9］研究，綜合細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；陽性細(xì)胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)：＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。每張切片讀取10個視野的平均值，將細(xì)胞染色強(qiáng)度計分和陽性細(xì)胞比例計分相加，作為最后積分。根據(jù)最后積分，0～1分為（-），＞1分且≤3分為弱陽性（+），＞3分且≤5分為陽性（++），＞5分為強(qiáng)陽性（+++）。以（+～+++）為陽性（圖1～2）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 17.0軟件分析。使用χ2檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)分析法分析臨床病理參數(shù)與免疫組化結(jié)果之間的相關(guān)性。假設(shè)檢驗(yàn)的檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 不同腎組織中BAI-1（A、C、E）及 P53表達(dá)（B、D、F）Figure 1 Expression of BAI-1 and P53 in different renal tissues

圖2VEGF（A、C、E）和MVD表達(dá)（B、D、F）Figure 2 Expression of VEGF and MVD in different renal tissues

2 結(jié)果

2.1 BAI-1在正常腎組織及腎細(xì)胞癌中的表達(dá)

正常腎臟中BAI-1含量明顯高于腎細(xì)胞癌組織（P＜0.01，表1）。ROC曲線下面積（Area）=0.890，標(biāo)準(zhǔn)誤（Std.Error）=0.020，P=0.000，95%CI：0.851～0.930，表明BAL-1的免疫組化結(jié)果對于腎細(xì)胞癌與正常組織的區(qū)分具有一定的診斷價值。Western blot檢測結(jié)果與免疫組化結(jié)果完全一致，腎細(xì)胞癌組織中BAI-1蛋白的含量明顯低于對應(yīng)的正常腎組織，并且與腫瘤的TNM分期相關(guān)（圖3）

2.2 BAI-1在不同臨床分期及病理分級腎細(xì)胞癌中的表達(dá)差異

早期腎細(xì)胞癌中BAI-1含量明顯高于晚期腎細(xì)胞癌（P＜0.05，表2，圖4）。ROC曲線下面積（Area）=0.741，標(biāo)準(zhǔn)誤（Std.Error）=0.051，P=0.000，95%CI：0.641～0.842，表明BAI-1的免疫組化結(jié)果對于腎細(xì)胞癌T1～2與T3～4的區(qū)分具有一定的診斷價值。

2.3 BAI-1表達(dá)與VEGF、MVD、P53的關(guān)系

通過統(tǒng)計學(xué)分析得出,133例腎細(xì)胞癌組織中BAI-1表達(dá)與P53正相關(guān)，與VEGF、MVD負(fù)相關(guān)（表3）。

圖3 腎細(xì)胞癌和正常腎組織中BAI-1蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of BAI-1 proteins in rienal cell carcinoma and normal renal tissues

圖4 BAI-1對不同臨床分期腎細(xì)胞癌的ROC曲線Figure 4 ROC curves for renal cell carcinoma in different clinical stages

表1 正常腎組織與腎細(xì)胞癌組織中BAI-1表達(dá)情況比較 n（%）Table 1 Comparison between the expression of BAI-1 in normal kidney tissues and renal cell carcinoma

表2 免疫組化檢測不同分期腎細(xì)胞癌組織中BAI-1表達(dá)情況 n（%）Table 2 Expression of BAI-1 in renal cell carcinoma at different stages

表3 BAI-1與MVD、VEGF、P53的相關(guān)關(guān)系分析Table 3 Analysis of the correlation between BAI-1 and MVD and VEGF and between BAI-1 and P53

3 討論

當(dāng)腫瘤直徑超過1～2 mm時，腫瘤生長所需的氧氣和養(yǎng)分供應(yīng)，主要依賴于新生血管的生長［10］。目前研究發(fā)現(xiàn)眾多血管生成因子調(diào)控著腫瘤血管的新生，正調(diào)節(jié)因子包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、血管生長素（angionenin）等，負(fù)調(diào)節(jié)因子包括血小板反應(yīng)蛋白（TBS）、血管抑素（angiostatin）、內(nèi)皮抑素（endostatin）等，這些因子作為腫瘤血管基因治療的靶分子受到人們的關(guān)注，有的已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。

BAI-1基因含有5個血小板凝血酶敏感蛋白1（TSP-1）重復(fù)序列，在體外可抑制由基底膜成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）誘發(fā)的血管新生，該基因至少有一個功能性的P53結(jié)合序列誘導(dǎo)P53活化，發(fā)揮抑癌基因的作用。

BAI-1在人腦、結(jié)腸、胃、肺以及胰腺等正常組織中均有表達(dá)，而在對應(yīng)惡性腫瘤中，BAI-1含量會明顯減少甚至不表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BAI-1在人正常腎組織中高表達(dá)，而在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)會減少甚至缺如，并且其表達(dá)減少程度與腎細(xì)胞癌惡性程度具有一定相關(guān)性。腎細(xì)胞癌惡性程度越高，BAI-1表達(dá)越少，在T3-4期腎細(xì)胞癌中甚至可以看到BAI-1完全不表達(dá)。這一結(jié)果證實(shí)了之前的猜想，BAI-1可能是一種潛在的抑癌蛋白，通過其抗腫瘤血管增生來抑制惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這可能與BAI-1的TSR重復(fù)區(qū)有關(guān)，該區(qū)域具有抑制腫瘤血管的生成功能，去除BAI-1就相當(dāng)于去除了腫瘤細(xì)胞內(nèi)血管生成的閥門從而使腫瘤內(nèi)血管生長加速。所以BAI-1的重新表達(dá)或者BAI-1的膜外片段成為治療腫瘤的新的一個靶標(biāo)蛋白。

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種分泌型糖蛋白，能夠特異性促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂［11］。其表達(dá)是大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞無限增殖的必要條件。VEGF的高表達(dá)與腫瘤患者的生存時間、早期復(fù)發(fā)、浸潤及轉(zhuǎn)移等有關(guān)［12-14］。MVD是衡量微血管形成的定量指標(biāo)，是將腫瘤中的微血管通過特異性抗原如Ⅷ因子相關(guān)抗原、CD34、CD31或CD105染色以顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞，然后在顯微鏡下計數(shù)微血管數(shù)量的一種方法，MVD可作為判斷泌尿系腫瘤惡性程度、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后的重要指標(biāo)。目前認(rèn)為CD34是最敏感的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，而且CD34標(biāo)記的MVD對預(yù)后的判斷價值也最大。

本實(shí)驗(yàn)通過對正常腎組織及不同分級腎細(xì)胞癌組織的對比研究分析發(fā)現(xiàn)，BAI-1含量與VEGF、MVD是成反比的。同時根據(jù)對BAI-1結(jié)構(gòu)的研究可以發(fā)現(xiàn)，BAI-1為跨膜蛋白，其胞膜外有2個功能區(qū)域，其中一個為血小板凝血酶敏感蛋白1（TSP1）重復(fù)區(qū)［15-16］。TSP1可以抑制由成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）誘導(dǎo)的新生血管生成，而VEGF可以受FGF調(diào)控［15］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也符合這一結(jié)果，BAI-1表達(dá)與VEGF、MVD呈負(fù)相關(guān)，從而證實(shí)了BAI-1在抑制腫瘤血管生長方面的作用。

BAI-1是在研究P53時被分離出來的，并且發(fā)現(xiàn)其受野生型P53表達(dá)調(diào)控，而在變異P53組織中無表達(dá)［17］，具體調(diào)控機(jī)制目前仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)中免疫組化結(jié)果顯示在腎細(xì)胞癌組織中P53含量明顯減少，同時其減少程度與腎細(xì)胞癌惡性度成正相關(guān)。而這種相關(guān)關(guān)系與BAI-1在不同惡性度腎細(xì)胞癌中的表達(dá)相符合，因此本實(shí)驗(yàn)猜測BAI-1在腎細(xì)胞癌中表達(dá)減少可能與P53突變有關(guān)，并且依據(jù)其突變程度決定其減少程度。

BAI-1因其結(jié)構(gòu)功能使其可能具有了抗腫瘤血管生長的作用，而且其作用機(jī)制、特性等至今仍不十分清楚，本實(shí)驗(yàn)通過對腎細(xì)胞癌組織進(jìn)行免疫組化檢測初步驗(yàn)證了BAI-1對VEGF、MVD之間關(guān)系，但尚需要進(jìn)一步研究。對BAI-1抑制腫瘤新生血管生成全面了解，將為惡性腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的探索和治療開辟新的道路。

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（2012-06-12收稿）（2013-02-01修回）

Expression of brain-specific angiogenesis inhibitor 1 and its correlation with VEGF,MVD,and P53 in renal cell carcinoma

Dawei TIAN,Yan SUN,Yuming YANG,Yang TANG,Mingde LEI,Ruifa HAN

Ruifa HAN;E-mail:jianshi001@126.com
Department Of Urology,Second Hospital Of Tianjin Medical University,Tianjin Institute Of Urology,Tianjin 300211,China

Objective:This study aims to compare the difference in the expression and localization of brain-specific angiogenesis inhibitor 1(bai-1)between human normal and clear cell carcinoma of kidney tissues at different clinical stages.this study also aims to explore the mechanism of bai-1-mediated inhibition of tumor endothelial cell proliferation.Methods:A total of 133 human normal and cancerous kidney tissues were obtained.the tissue localized more than 4 cm away from the cancerous kidney tissue was identified as the normal control kidney tissue.immunohistochemical staining was conducted to detect the expression of bai-1,vegf,mvd,and p53.the expression was detected with the respective antibodies for quantitative statistical analysis.fresh renal cell carcinoma tissue samples were obtained from 27 patients,and 15 tissue samples were obtained 4 cm away from the cancer.the expression of bai-1 in the renal cell carcinoma tissue was examined through western blot analysis.Results:The bai-1 expression level in the normal kidney tissues is much higher compared with that in the kidney cancer tissues,which ranged from low and moderate to high differentiated stages.statistical analysis results revealed a correlation between the expression of bai-1 and vegf,mvd,and p53 proteins.Conclusion:The expression level of bai-1 in kidney cancer tissues is very low,even difficult to detect,compared with the increased expression of vegf and cd34.this finding suggests that bai-1 can inhibit tumor angiogenesis.the level of p53 is positively correlated with the expression of bai-1 according to the data derived with the spearman software,suggesting the existence of crosstalk between these two molecules.

BAI-1,renal cell carcinoma,P53,VEGF,targeted therapy,MVD

10.3969/j.issn.1000-8179.2013.06.009

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津市南開醫(yī)院（天津市300211）

韓瑞發(fā) jianshi001@126.com

（本文編輯：鄭莉）