劉欣榮 郭亞東 谷永紅

腦紅蛋白在膠質瘤中的表達及其臨床意義

劉欣榮 郭亞東 谷永紅

目的：檢測腦紅蛋白（neuroglobin，Ngb）在人腦膠質瘤中的表達并探討其臨床意義。方法：2011年5月至2012年3月在中南大學湘雅醫(yī)院及湘雅三醫(yī)院病理科收集膠質瘤樣本98例，應用免疫組織化學SP法檢測腦紅蛋白在不同組織學類型及WHO級別的膠質瘤中的表達情況及其與Ki-67表達的關系。結果：98例腦膠質瘤中，Ngb的總陽性率為88.78%，Ki-67均出現(xiàn)不同程度的陽性表達。1）按組織學類型分類，發(fā)現(xiàn)63例星形膠質細胞瘤中，Ngb表達陰性、弱陽性、中度陽性、強陽性的例數(shù)分別為2、20、26和15例；9例少突細胞膠質瘤均為陰性表達；15例少突星形細胞瘤中13例呈弱陽性表達，2例為中等陽性表達；11例室管膜腫瘤中，中等陽性表達有9例，強陽性表達為2例，經非參數(shù)檢驗發(fā)現(xiàn)，四種組織學類型中Ngb的陽性程度均存在差異，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2）按WHO分級分類，發(fā)現(xiàn)11例Ⅰ級膠質瘤中2例Ngb呈陰性表達，9例為弱陽性表達；39例Ⅱ級膠質瘤中Ngb表達陰性、弱陽性、中度陽性、強陽性的例數(shù)分別為5、13、16和5例；而在29例Ⅲ級中分別為4、11、11和3例；19例Ⅳ級膠質瘤中10例呈中等程度陽性表達，9例呈強陽性表達，經Kruskal-Wallis秩和檢驗發(fā)現(xiàn)，隨膠質瘤WHO級別越高，Ngb的陽性程度越高，各WHO級別之間Ngb的陽性程度差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3）Ki-67與Ngb的相關分析發(fā)現(xiàn)，不同陽性程度的Ngb的表達與核增殖指數(shù)Ki-67之間存在正相關關系（rs=0.47，P＜0.05）。結論：通過對不同組織學類型和不同WHO級別的膠質瘤中Ngb的表達及其與Ki-67指數(shù)關系的研究，表明Ngb在膠質瘤的診斷、治療、評價惡性程度和預后中有重要意義，尤其在膠質瘤的治療中有廣闊的發(fā)展前景。

腦紅蛋白 膠質瘤 免疫組織化學 WHO分級 Ki-67

腦紅蛋白（neuroglobin，Ngb）是2000年Burmester發(fā)現(xiàn)的主要位于中樞神經系統(tǒng)的能可逆性結合氧分子的攜氧球蛋白［1］。大量研究證實Ngb為代謝活躍的神經細胞供氧［2-3］，清除體內氧自由基［4］，對抗氧化應激［5］，保護神經系統(tǒng)免受缺血缺氧損傷，為中風和神經系統(tǒng)退行性病變的治療帶來新的希望。早期研究認為Ngb定位于神經元細胞質內［6］，而在星形膠質細胞中尚未報道。近期Ngb在膠質瘤中的研究相對比較少見，2010年Emara等［7］發(fā)現(xiàn)Ngb在人星形細胞膠質瘤組織中有表達，2012年Qin等［8］證實基因水平上Ngb在大鼠星形細胞瘤細胞株C6和人星形細胞瘤細胞株U251中呈陽性表達。但是Ngb在膠質瘤的診斷、治療和預后中的具體作用及機制仍不明確。因此本研究應用免疫組織化學SP法檢測98例人腦膠質瘤樣本中Ngb的表達情況，并分析不同組織學類型、WHO級別膠質瘤中Ngb的表達情況及其與Ki-67指數(shù)的關系，為今后探討Ngb在膠質瘤的診斷、分級、治療和預后中的作用及機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器 腦紅蛋白單克隆抗體（購自中國軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所），Ki-67即用型抗體（購自福州邁新公司），抗體稀釋液（購自中杉金橋公司），免疫組化試劑盒（購自福州邁新公司），DAB顯色試劑盒（購自福州邁新公司），光學顯微鏡（Olympus CX41）。

1.1.2 樣本 2011年5月至2012年3月在中南大學湘雅醫(yī)院及湘雅三醫(yī)院病理科收集人腦膠質瘤標本98例，其中男性46例，女性52例，平均年齡38.81歲。其中星形膠質細胞瘤63例，少突細胞膠質瘤9例（其中間變型少突細胞膠質瘤4例），少突星形細胞瘤15例，室管膜腫瘤11例。同時，按照WHO神經系統(tǒng)腫瘤分級標準（2007），Ⅰ級11例，Ⅱ級39例，Ⅲ級29例，Ⅳ級19例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學 采用SP法進行免疫組織化學檢測。具體步驟為：石蠟切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水沖洗，0.01 mol/L PBS浸泡5 min；3%H2O2水溶液浸泡15 min；微波爐抗原修復20 min，室溫冷卻；10%正常羊血清白蛋白孵育15 min，棄去；每切片加50 μL Ngb單抗（1∶100稀釋）或即用型Ki-67抗體，4℃冰箱孵育過夜；每切片加50 μL生物素標記羊抗小鼠IgG工作液，37℃孵育25 min；每切片加50 μL辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育25 min；滴加DAB顯色液顯色5 min，PBS沖洗停顯；然后蘇木精復染、脫水、透明、中性樹膠封片并拍照分析。陽性對照為人正常小腦組織（圖1A），陰性對照為骨骼?。▓D1B），空白對照為大腦組織（圖1C）［7］。

圖1 Ngb的免疫組織化學染色（×400）Figure 1 Control of Ngb by IHC

1.2.2 結果判斷 Ngb陽性表達定位于胞質，呈黃色或棕黃色顆粒狀。Ki-67蛋白的表達在細胞核或細胞質內，呈棕黃色染色為陽性。隨機觀察5個高倍視野，以陽性細胞比例的平均值計算陽性細胞的百分比［9］：無陽性細胞為陰性（-），陽性細胞數(shù)1%～25%為弱陽性（+），26%～50%為中度陽性（++），＞50%為強陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計學SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，應用非參數(shù)檢驗、Kruskal-Wallis秩和檢驗和Spearsman相關分析的統(tǒng)計方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同組織學類型膠質瘤Ngb的表達

膠質瘤中Ngb的總陽性率為88.78%，少突膠質細胞腫瘤Ngb表達陰性（圖2A），96.83%（61/63）星形細胞腫瘤Ngb呈陽性表達，室管膜腫瘤（圖2B）及少突星形細胞腫瘤樣本中Ngb均有不同程度陽性表達。尤其在胞漿豐富、含有大量線粒體的肥胖型星形膠質細胞瘤（圖2C）和膠質母細胞瘤（圖2D為巨細胞型膠質母細胞瘤）呈強陽性表達。

少突膠質細胞瘤和間變型少突膠質細胞瘤Ngb表達陰性，其余類型膠質瘤中除2例毛細胞星形細胞膠質瘤為陰性外，均呈不同程度陽性表達。15例少突星形細胞腫瘤Ngb呈+～++程度陽性表達，其中的少突細胞成分Ngb呈陰性表達。11例室管膜腫瘤Ngb呈++～+++陽性表達。63例星形細胞腫瘤中Ngb-～+++表達的百分率分別為3.17%、31.75%、41.27%和23.81%。尤其在胞漿豐富、含有大量線粒體的膠質母細胞瘤和肥胖型星形膠質細胞瘤Ngb呈強陽性表達。用非參數(shù)檢驗發(fā)現(xiàn)四種組織學類型膠質瘤的Ngb陽性表達程度均不同，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表 1）。

2.2 不同WHO級別神經系統(tǒng)腫瘤Ngb的表達

11例WHOⅠ級膠質瘤中，除2例毛細胞星形細胞瘤為陰性外，其余9例毛細胞星形細胞瘤和室管膜下巨細胞星形細胞瘤均呈弱陽性表達，陽性細胞胞質顯淡黃色。39例WHOⅡ級的膠質瘤Ngb-～+++表達的百分率分別為12.82%、33.33%、41.03%和12.82%。29例WHOⅢ級的膠質瘤Ngb-～+++表達的百分率分別為13.79%、37.93%、37.93%和10.34%。19例WHOⅣ級的膠質瘤均為中到強陽性表達，陽性細胞胞質表現(xiàn)為深黃色或黃褐色顆粒狀著色。用Kruskal-Wallis秩和檢驗，發(fā)現(xiàn)WHO級別越高的膠質瘤其Ngb的陽性表達程度越高，各級別間的Ngb表達差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。

2.3 膠質瘤中Ngb的表達與核增殖指數(shù)Ki-67之間的相關性

98例膠質瘤表現(xiàn)出不同程度的Ki-67陽性（表2，圖3）。Ki-67弱陽性表達所占比例最高，為40.82%，強陽性表達所占比例最低，僅有7.14%。經Spearsman相關分析發(fā)現(xiàn)Ngb的表達與核增殖指數(shù)Ki-67之間存在正相關（rs=0.47，P＜0.05），膠質瘤中Ngb的陽性程度越高，則Ki-67的陽性程度越高。

表2 膠質瘤中Ngb的表達與Ki-67的表達的關系Table 2 Correlation between the expression of Ngb and Ki-67

圖3 膠質瘤中不同程度的Ki-67的表達（SP×400）Figure 3 Different degrees of Ki-67 expression in gliomas by IHC（SP×400）

3 討論

腦紅蛋白作為珠蛋白家族的一個新成員，具有高度氧親和力，可逆性地結合氧，存儲和促進氧向線粒體擴散，對組織細胞氧代謝、氧利用有重要作用［10］。在大腦缺血缺氧的狀態(tài)下，腦紅蛋白在神經元中的表達上調，減少缺血缺氧對神經元的損傷。在膠質瘤瘤細胞的發(fā)展過程中，供氧對其生長增殖有著重要的影響。而具有高度氧親和力的腦紅蛋白在此環(huán)節(jié)中所起到的作用及其機制仍尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)四種不同組織學類型膠質瘤的腦紅蛋白陽性表達程度均不同，且WHO級別越高，Ngb的陽性表達程度越高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外Ngb的表達程度與細胞核增殖指數(shù)Ki-67均存在正相關關系（rs=0.47，P＜0.05）。

少突膠質細胞腫瘤和少突星形細胞腫瘤中前者胞漿比較少，其內含的線粒體也相對少。而線粒體是Ngb的氧代謝作用重要的中介［1］，因此，在線粒體數(shù)目少、功能相對不活躍的少突膠質細胞中，Ngb呈陰性表達。2例WHOⅠ級的毛細胞性星形細胞瘤，其分化程度較好，細胞大小形態(tài)較一致，惡性程度、細胞異型性和結構異型性都較低，無核分裂像，預后也相對較好，Ngb呈陰性表達。而在胞漿相對豐富的肥胖型星形膠質細胞、膠質母細胞瘤和巨細胞型膠質母細胞瘤，陽性表達程度比其余類型腫瘤細胞高，此外，室管膜腫瘤Ngb的陽性表達程度也較高。室管膜腫瘤作為脊髓內最常見的膠質瘤類型，占50%～60%。瘤細胞來源于腦室壁上的室管膜細胞和室管膜下的膠質細胞，主要包括室管膜下瘤、黏液乳頭型室管膜下瘤、室管膜瘤和間變型室管膜瘤，除間變型室管膜瘤屬于WHOⅢ級外，其余均屬WHOⅡ級。室管膜腫瘤細胞的胞漿相對比少突膠質細胞瘤的胞漿更豐富，Ngb的陽性表達程度也顯著高于少突膠質細胞瘤。這些胞漿豐富的瘤細胞，線粒體相對發(fā)達，氧代謝和功能活動相對活躍，Ngb表達也較高，腫瘤細胞對抗缺氧微環(huán)境的能力也較強，表明Ngb可能與細胞的氧代謝及功能活動有關。

Ngb在各級膠質瘤中均可見陽性表達，WHO分級越高則表達程度越高。而膠質瘤的WHO分級與其預后密切相關，據(jù)文獻報道［11］，分化較好的膠質瘤（WHOⅡ級）生存時間在5年以上，分化不良的膠質瘤（WHOⅢ級）生存時間在2～5年，分化差的膠質瘤（WHOⅣ級）生存時間不足1年。WHO分級越高則Ngb的表達程度越高，提示Ngb可能在一定程度上反映膠質瘤的惡性程度，可作為評價膠質瘤細胞惡性程度及判斷腫瘤預后的重要指標。

Ki-67是細胞核內與細胞分裂增殖相關的蛋白抗原，是應用廣泛的細胞增殖標志物。本研究中，Ngb和Ki-67在腦膠質瘤中的存在正相關關系（rs=0.47，P＜0.05），提示膠質瘤中Ngb陽性表達程度越高，則瘤細胞核的增殖指數(shù)越高，增殖的速度越活躍。Ngb在一定程度上反映了膠質瘤腫瘤細胞的增殖活性，對預測腫瘤的生物學特性和惡性程度有一定的意義。

腦紅蛋白在腫瘤細胞中的作用機制可能有：抗凋亡作用和供氧作用。2010年Raychaudhuri等［12］研究發(fā)現(xiàn)在缺氧狀態(tài)下，腦紅蛋白可通過阻斷內源性細胞凋亡途徑，干預前凋亡蛋白酶-9與細胞色素C的相互作用，抑制神經元的凋亡，從而起到保護神經元的作用。在膠質瘤中，由于腫瘤的生長，瘤體的增大，需氧量也大大增加，腫瘤處于相對缺氧的微環(huán)境中，腦紅蛋白作為一種攜氧球蛋白表達明顯上調，通過供氧作用，以緩解腫瘤細胞的缺氧狀態(tài)。缺氧誘導Ngb表達的機制目前仍不清楚，有學者認為缺氧誘導因子HIF-1可能在其中起介導作用［13-15］。且對Ngb基因結構分析發(fā)現(xiàn)，在Ngb的啟動子區(qū)域含有兩個P53的結合位點，提示Ngb的表達可能受到P53的調控。而P53基因又是HIF-1的下游調控因子，因此可能存在這樣一種傳導通路：“缺氧→HIF-1→P53→Ngb表達增加→加強氧攝取與氧利用能力/降低細胞的能量消耗等→改善缺氧微環(huán)境”。這兩種可能的作用機制都表明腦紅蛋白在促進腫瘤的生長增殖方面有著重要的聯(lián)系。

目前，膠質瘤的治療主要還是以手術切除為主，必要時聯(lián)合放療或化療，治療效果各有差異，患者身體的基本情況、腫瘤生長的位置、大小、惡性程度以及是否手術完全切除都直接影響到患者的生存率。膠質瘤患者的治療在一定程度上仍有待提高。而是否能夠通過拮抗人腦膠質瘤中腦紅蛋白的表達，從而阻斷Ngb的抗凋亡作用或使腫瘤細胞持續(xù)處于缺氧微環(huán)境中，抑制腫瘤細胞的生長，加速腫瘤細胞的死亡，為膠質瘤的治療和改善膠質瘤的預后提供一種新的思路和方法，還有待于進一步研究。

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（2012-07-13收稿）

（2013-01-20修回）

Expression and clinical significance of neuroglobin in gliomas

Xinrong LIU,Yadong GUO,Yonghong GU

Yonghong GU;E-mail:guyonghong0815@yahoo.cn
Department of Pathology,Third Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410013,China

Objective:The present study aimed to detect the expression and clinical significance of neuroglobin(Ngb)in gliomas.Methods:The immunohistochemical method was used to detect the expression of Ngb in gliomas of different histological types and WHO degrees as well as the correlation between Ngb and the Ki-67 positive index.Results:The total positive rate of Ngb in the gliomas was 88.76%.1)According to the four different histological types of gliomas,among the 63 cases of astrocytoma,Ngb was expressed as negative,weak positive,moderate positive,and strong positive in 2,20,26,and 15 cases,respectively.The nine cases of oligodendrocytes glioma were all negative for Ngb expression.A total of 13 out of the 15 oligoastrocytoma cases showed a weak positive expression of Ngb,whereas the other two cases showed a moderate positive Ngb expression.Out of the 11 ependymoma cases,nine were moderate positive cases and two were strong positive cases.The expression levels of Ngb were significantly different(P＜0.05)among the four different histological types of gliomas.2)According to the different WHO levels of gliomas,two gliomas of WHO I degree were negative for Ngb expression,whereas the other nine cases showed a weak positive expression of Ngb.Among the 39 gliomas of WHO II degree,Ngb was expressed as negative,weak positive,moderate positive,and strong positive in 5,13,16,and 5 cases,respectively,whereas among the 29 gliomas of WHO III degree,the number of cases were 4,11,11,and 3.Ten cases exhibited moderate positive Ngb expression,whereas nine cases showed strong positive expression for the WHO IV degree.Ngb expression levels between every two different WHO degrees were significantly different(P＜0.05).A higher WHO degree generates a stronger Ngb expression.3)Ngb has a significant correlation with Ki-67.Ngb is positively correlated with the Ki-67 positive index(rs=0.47,P＜0.05).Conclusion:The expression level in gliomas of different histological types and WHO degrees and the significant correlation between the expression level of Ngb and Ki-67 positive index show that Ngb plays a role in the diagnosis,therapy,judgment of malignant degree,and prognosis of gliomas.Ngb can be further developed to treat gliomas.

neuroglobin,glioma,immunohistochemistryl,WHO classification,Ki-67

10.3969/j.issn.1000-8179.2013.06.007

中南大學湘雅三醫(yī)院病理科（長沙市410013）

谷永紅 guyonghong0815@yahoo.cn

（本文編輯：王展宏）