曹守強(qiáng) 趙桂彬 董慶 韓敬泉 辛衍忠 閆宇博 李吉堯 崔鍵

肺癌是導(dǎo)致人類死亡的第一高發(fā)癌癥。肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的一種，雖然可以通過手術(shù)切除和放化療進(jìn)行治療，但患者預(yù)后通常較差。近幾年隨著小分子靶向藥物治療的興起，使部分肺腺癌患者的生存期明顯延長(zhǎng)，生活質(zhì)量得到改善。然而臨床研究[1]表明，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變陽(yáng)性的肺腺癌患者對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）的有效率可達(dá)70%-80%，而野生型的患者有效率僅約10%-20%，治療存在局限性。即便EGFR-TKI初始治療有效的患者，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，最終幾乎都會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥，而且，嚴(yán)重的皮膚副反應(yīng)等并發(fā)癥常使很多患者被迫停藥。以上種種問題限制了EGFR-TKI的推廣使用，在不久的將來，EGFR-TKI必將被副作用小、適用人群廣的靶向藥物所取代。

STAT5是STAT家族中的成員，受細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子激活后發(fā)生磷酸化改變，由細(xì)胞漿穿梭入細(xì)胞核，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并在細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化過程中起到關(guān)鍵作用。在人體內(nèi)很多組織存在STAT5的表達(dá)，而且血液、乳腺、頭頸部及前列腺腫瘤等存在STAT5的激活，其參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等生物學(xué)行為。COX-2是COX家族中的一員，COX-2在多種實(shí)體瘤如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌中均存在較高表達(dá)，并參與了腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡、腫瘤侵襲、血管發(fā)生及腫瘤轉(zhuǎn)移等過程。越來越多的研究表明COX-2在肺癌發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用，COX-2的過度表達(dá)可以抑制細(xì)胞調(diào)亡，刺激血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致肺癌疾病進(jìn)展[2]，并可作為判斷肺癌預(yù)后的指標(biāo)[3]。而COX-2抑制劑無論與其它藥物聯(lián)合治療或單獨(dú)使用，均因其對(duì)肺癌血管生成的抑制而具有治療作用[2]。因此，COX-2成為肺癌未來診斷與治療研究的新熱點(diǎn)。但在肺腺癌中COX-2是否受到細(xì)胞因子的刺激后表達(dá)發(fā)生改變，以及STAT5是否參與了COX-2表達(dá)的調(diào)控等機(jī)制至今仍不明確。帶著這些疑問，我們對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞中STAT5對(duì)COX2的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。STAT5和p-STAT5a/b兔抗人抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。STAT5短片斷干擾RNA（small interfer RNA, siRNA）（ON-TARGETplus SMARTpool siRNA），ON-TARGETplus Non-targeting siRNA（陰性對(duì)照）及DharmaFECT siRNA轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)Dharmacon公司。STAT5顯性負(fù)突變體（AdCMV5 Stat5a△740）及野生型STAT5（AdWTSTAT5）質(zhì)粒由名古屋市立大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院Hiroko Yamashita教授惠贈(zèng)。ProteoJETTM細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購(gòu)自加拿大Fermentas公司。蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Milipore公司。Bradford蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。含有STAT5結(jié)合位點(diǎn)的生物素標(biāo)記雙鏈探針（5'-biotin-AGATTTCTAGGAATTCGCAG-3'）購(gòu)自美國(guó)Affymetrix公司。DuoSet IC（Intracellular）Active Transcription Factor Assays（用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合實(shí)驗(yàn)）購(gòu)自英國(guó)R&D公司。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司。PCR所用引物均由大連TaKaRa公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株A549用含有10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）在37oC、5%CO2、相對(duì)濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨后將細(xì)胞接種于12孔板中進(jìn)行EGF（Invitrogen公司，100 ng/mL）激活實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)染研究。

1.2.2 免疫熒光法檢測(cè)STAT5核穿梭現(xiàn)象 A549細(xì)胞爬片24 h，待細(xì)胞伸展并牢固貼附玻片后用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）洗滌細(xì)胞，更換為含0.1%血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)過夜。次日更換為含100 ng/mL EGF和10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，1 h后，用PBS沖洗，4%多聚甲醛固定10 min，0.25% Triton X-100透化處理細(xì)胞，5%胎牛血清封閉1 h，用兔抗人STAT5或p-STAT5a/b一抗（1:100稀釋）4oC孵育過夜。PBS洗滌后，用FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（1:200稀釋）孵育2 h。Hoechst33258細(xì)胞核染色后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 STAT5 siRNA的轉(zhuǎn)染及分組研究 待A549細(xì)胞鋪滿板底約80%-90%時(shí)，根據(jù)商品說明書使用DharmaFECT siRNA轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行STAT5 siRNA轉(zhuǎn)染（50 nM）。ON-TARGETplus Non-targeting siRNA作為陰性對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h后Western blot法驗(yàn)證沉默效率。并根據(jù)研究需要分為6組：未轉(zhuǎn)染組；轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA組；EGF刺激組；轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA加EGF刺激組；轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA加EGF刺激組；轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA組。

1.2.4 STAT5顯性負(fù)突變體（dominant negative mutant,DN）及野生型STAT5的轉(zhuǎn)染及分組研究 腺病毒介導(dǎo)的Stat5a△740 Stat5a能夠阻斷STAT5的信號(hào)通路的激活[4]。待A549細(xì)胞鋪滿板底約70%-80%時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。取2支EP管，于一管中加入10 μg質(zhì)粒和500 μL無血清、無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基，另一管加入20 μg Lipofectamine 2000和500 μL無血清、無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基。兩管混合后，室溫放置30 min，再加1 mL RPMI-1640培養(yǎng)基，混勻。吸出孔板中舊培養(yǎng)基，用無血清、無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌一遍，然后加入已混勻的上述兩種混合液。2 h后，倒掉混合液，更換為含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72 h后Western blot法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。并根據(jù)研究需要分為5組：未轉(zhuǎn)染組；轉(zhuǎn)染野生型STAT5組；EGF刺激組；轉(zhuǎn)染STAT5顯性負(fù)突變體加EGF刺激組；轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA加EGF刺激組。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合實(shí)驗(yàn) 將干預(yù)后細(xì)胞分為如下5組：未轉(zhuǎn)染組；轉(zhuǎn)染野生型STAT5組；EGF刺激組；轉(zhuǎn)染STAT5顯性負(fù)突變體加EGF刺激組；轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA加EGF刺激組。根據(jù)試劑盒說明書提取各組細(xì)胞核蛋白。使用Bradford蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。根據(jù)文獻(xiàn)[5]指導(dǎo)進(jìn)行操作。一抗為兔抗人p-STAT5（100 μL/1:100），二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體（100 μL/1:200）。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)上述處理后，根據(jù)試劑盒說明書分別提取細(xì)胞核蛋白，細(xì)胞漿蛋白和總蛋白，首先進(jìn)行蛋白定量，從每組中取50 μg蛋白提取物進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉PBS/0.1%Tween20封閉30 min，加入1:1,000倍稀釋的一抗（STAT5或p-STAT5），以β-actin或Histone H1為內(nèi)參，4oC孵育過夜。PBS/0.1% Tween20洗膜后加入二抗室溫孵育2 h。PBS/0.1% Tween20洗膜后ECL發(fā)光，用Chemi-genius凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.2.7 半定量RT-PCR檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)過上述處理后，收集細(xì)胞，用Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA。取總RNA 500 ng進(jìn)行cDNA第一鏈合成，根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書合成模板。引物序列如下：COX-2（forward:5'-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3'; reverse:5'-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3'），β-actin（forward: 5'-AAATCGTGCGTGACATTAA-3'; reverse: 5'-CTCGTCATACTCCTGCヰG-3'）。PCR體系在94oC下變性2 min，循環(huán)條件為94oC、30 s，55oC、30 s，72oC、30 s，共25個(gè)循環(huán)，最后延伸10 min。取產(chǎn)物5 μL通過電泳利用瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，并在紫外線燈下照相。最后通過凝膠灰度分析儀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGF對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞中STAT5活化的影響 為明確在體外A549細(xì)胞中是否存在STAT5的激活，以及EGF是否可以促進(jìn)STAT5的活化，我們用EGF對(duì)細(xì)胞刺激后進(jìn)行了免疫熒光染色。在熒光顯微鏡下，我們發(fā)現(xiàn)在部分未經(jīng)處理的A549細(xì)胞中活化的STAT5（p-STAT5）主要位于細(xì)胞漿，且處于極低的激活水平，而在部分細(xì)胞則無p-STAT5的表達(dá)。EGF刺激A549細(xì)胞后STAT5部分活化穿梭入細(xì)胞核，而且呈高水平激活（圖1）。在未經(jīng)處理的A549細(xì)胞中STAT5位于細(xì)胞漿內(nèi)，呈高水平表達(dá)。EGF刺激A549細(xì)胞后細(xì)胞漿內(nèi)STAT5的表達(dá)無明顯改變（圖2）。經(jīng)Western blot分析，結(jié)果顯示，在未經(jīng)處理的A549細(xì)胞核中無p-STAT5的表達(dá)，而經(jīng)EGF激活后，細(xì)胞核中的p-STAT5呈高表達(dá)（圖3A）。在EGF刺激A549細(xì)胞前后，細(xì)胞漿內(nèi)的STAT5均呈高表達(dá)，且無明顯差異（圖3B）。

2.2 STAT5 siRNA對(duì)A549細(xì)胞中STAT5蛋白表達(dá)的影響及對(duì)COX-2 mRNA表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA細(xì)胞中STAT5蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），提示STAT5 siRNA能明顯阻斷STAT5的表達(dá)，而EGF刺激后對(duì)STAT5的表達(dá)無明顯影響（圖4A）。另一方面，與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA細(xì)胞中COX-2 mRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。EGF雖然可以使COX-2 mRNA表達(dá)明顯升高，但在轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA細(xì)胞中，此作用被明顯削減（P＜0.05，圖4B）。

2.3 野生型STAT5及STAT5顯性負(fù)突變體對(duì)A549細(xì)胞中STAT5、p-STAT5蛋白及COX-2 mRNA表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與未處理組的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染野生型STAT5細(xì)胞中STAT5蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），而對(duì)p-STAT5蛋白表達(dá)無明顯影響。轉(zhuǎn)染STAT5顯性負(fù)突變體細(xì)胞對(duì)STAT5表達(dá)無明顯影響，但Western blot可見突變體條帶，而且，轉(zhuǎn)染STAT5顯性負(fù)突變體后，EGF對(duì)STAT5的活化作用也被明顯削弱（P＜0.05，圖5A，圖5B），提示STAT5顯性負(fù)突變體有阻斷STAT5激活的作用。另一方面，與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染野生型STAT5細(xì)胞中COX-2 mRNA的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），提示非磷酸化的STAT5在A549細(xì)胞中有調(diào)節(jié)COX-2表達(dá)的作用。轉(zhuǎn)染STAT5顯性負(fù)突變體細(xì)胞中，EGF上調(diào)COX-2 mRNA的作用被明顯削弱（P＜0.05，圖5C），提示p-STAT5在A549細(xì)胞中同樣具有調(diào)節(jié)COX-2表達(dá)的功能。

圖 1 A549細(xì)胞和EGF刺激A549細(xì)胞后p-STAT5的免疫熒光染色分析。A：p-STAT5在A549細(xì)胞中的表達(dá)；B：A549細(xì)胞的核染色；C：A與B的重疊圖像；D：EGF刺激后p-STAT5在A549細(xì)胞中的表達(dá)；E：A549細(xì)胞的核染色；F：D與E的重疊圖像。Fig 1 Immunofluorescence of p-STAT5 in resting and EGF-stimulated human lung adenocarcinoma A549 cells. Upper panels, no EGF stimulation;lower panels, EGF stimulation. (A) and (D), p-STAT5 staining; (B) and (E), Hoechst33258 staining of nuclei; (C) and (F), merged images.

圖 2 A549細(xì)胞和EGF刺激A549細(xì)胞后STAT5的免疫熒光染色分析。A：STAT5在A549細(xì)胞中的表達(dá)；B：A549細(xì)胞的核染色；C：A與B的重疊圖像；D：EGF刺激后STAT5在A549細(xì)胞中的表達(dá)；E：A549細(xì)胞的核染色；F：D與E的重疊圖像。Fig 2 Immunofluorescence of STAT5 in resting and EGF-stimulated human lung adenocarcinoma A549 cells. Upper panels, no EGF stimulation;lower panels, EGF stimulation. (A) and (D), STAT5 staining; (B) and (E), Hoechst33258 staining of nuclei; (C) and (F), merged images.

2.4 A549細(xì)胞中STAT5表達(dá)的變化和STAT5活化對(duì) DNA結(jié)合活性的影響 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未處理組的細(xì)胞相比，EGF刺激后的細(xì)胞的STAT5 DNA結(jié)合活性明顯升高（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染野生型STAT5的細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)STAT5 DNA結(jié)合活性發(fā)生改變。而轉(zhuǎn)染STAT5顯性負(fù)突變體和STAT5 siRNA的細(xì)胞中，EGF對(duì)STAT5 DNA結(jié)合活性的刺激作用被抑制（圖6）。提示STAT5顯性負(fù)突變體和STAT5 siRNA有抑制STAT5 DNA結(jié)合活性的作用，從而影響STAT5的轉(zhuǎn)錄活性。

圖 3 EGF刺激對(duì)A549細(xì)胞核p-STAT5（A）和細(xì)胞漿STAT5（B）表達(dá)影響的免疫印跡分析Fig 3 P-STAT5 (A) and STAT5（B) expression induced by EGF in human lung adenocarcinoma A549 cells. Western blot analysis of nucleus extracts from EGF-stimulated and resting A549 human lung adenocarcinoma cells showing upregulation of nucleus p-STAT5 (A) and no significant of cytoplasmic STAT5 (B).

圖 4 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA后以及受到EGF刺激后對(duì)STAT5表達(dá)影響的免疫印跡分析（A）和COX-2 mRNA表達(dá)影響的電泳分析（B）。A549：未轉(zhuǎn)染組；CtrlsiRNA：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA組；EGF：EGF刺激組；EGF+CtrlsiRNA：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA加EGF刺激組；EGF+siRNA：轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA加EGF刺激組；STAT5 siRNA：轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA組。Fig 4 Western blot analysis of STAT5 expression (A) and electrophoresis analysis of COX-2 expression (B) in A549 cells transfected with STAT5 siRNA together with or without EGF stimulation. A549: untransfected; CtrlsiRNA: transfected with control siRNA; EGF: stimulation with EGF;EGF+CtrlsiRNA: transfected with control siRNA and stimulation with EGF; EGF+STAT5 siRNA : transfected with STAT5 siRNA and stimulation with EGF; STAT5 siRNA: transfected with STAT5siRNA.

3 討論

自1992年Fu發(fā)現(xiàn)了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子以來，國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者對(duì)STAT家族進(jìn)行了大量研究，證實(shí)STAT家族成員參與了多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等。研究顯示，在許多惡性腫瘤中，包括白血病[6]、乳腺癌[7]、前列腺癌[8]、頭頸癌[9]及NSCLC[10]中均存在STAT的異常激活。STAT激活后發(fā)生磷酸化，形成二聚體并穿梭入細(xì)胞核，入核后的STAT與同源的DNA結(jié)合區(qū)域相結(jié)合誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活[11]。在NSCLC中已被證實(shí)存在STAT酪氨酸磷酸化現(xiàn)象[12]。

圖 5 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型STAT5，STAT5顯性負(fù)突變體和STAT5 siRNA后以及受到EGF刺激后對(duì)STAT5（A）、p-STAT5（B）表達(dá)影響的免疫印跡分析和COX-2 mRNA表達(dá)影響的電泳分析（C）。Ctrl：未轉(zhuǎn)染組；WT-STAT5：轉(zhuǎn)染野生型STAT5組；EGF：EGF刺激組；EGF+DN-STAT5：轉(zhuǎn)染STAT5顯性負(fù)突變體加EGF刺激組；EGF+STAT5 siRNA：轉(zhuǎn)染STAT5 siRNA組加EGF刺激組。Fig 5 Western blot analysis of STAT5 (A), p-STAT5 (B) and electrophoresis analysis of COX-2 (C) expression in A549 cells transfected with WT-STAT5,DN-STAT5 and STAT5 siRNA together with or without EGF stimulation. Ctrl, transfected with control adenovirus; WT-STAT5, transfected with wildtype STAT5; EGF, stimulation with EGF; EGF+DN-STAT5, transfected with dominant negative STAT5 and stimulation with EGF; EGF+STAT5 siRNA,transfected with STAT5 siRNA and stimulation with EGF.

在STAT家族的7個(gè)成員中，目前研究最為深入和廣泛的是STAT3和STAT5。STAT5分為STAT5a和STAT5b兩種亞型，STAT5位于細(xì)胞漿內(nèi)，受細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子刺激，在酪氨酸激酶，特別是JAK激酶的作用下，其羧基末端結(jié)構(gòu)域的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而使STAT5發(fā)生活化[13]。磷酸化的STAT5形成同源或異源的二聚體，穿梭入細(xì)胞核內(nèi)，識(shí)別并結(jié)合到靶基因特異啟動(dòng)子的反應(yīng)元件中[14]。

RNA干擾（RNA interference, RNAi）技術(shù)是用來研究基因功能的最常用工具，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptonal gene silencing, PTGS）。而顯性負(fù)突變體是通過顯性負(fù)性作用而產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)效應(yīng)，在蛋白水平起競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，對(duì)目的基因表達(dá)無影響，能夠和正常受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合配體，但是顯性負(fù)突變體無信號(hào)傳導(dǎo)功能，因此對(duì)該受體功能起到抑制作用，并對(duì)該受體的表達(dá)未造成影響，而siRNA則會(huì)導(dǎo)致該受體表達(dá)水平下降。因此，siRNA和顯性負(fù)突變體是在不同水平起作用的。STAT5是通過磷酸化及去磷酸化來實(shí)現(xiàn)其作用的，磷酸化后生成的蛋白量很少，若僅用siRNA來抑制目的基因表達(dá)并不能完全闡釋STAT5的功能。而用顯性負(fù)突變體則可以代替功能蛋白來研究其缺失后狀態(tài)，并對(duì)研究人類癌細(xì)胞的基因功能非常有用。STAT5顯性負(fù)突變體的特點(diǎn)是使激活域的C末端的部分或完全失活。Stat5a△740是表達(dá)負(fù)顯性STAT5的質(zhì)粒，保留了二聚體形成及DNA結(jié)合區(qū)域中保守的酪氨酸殘基，可對(duì)STAT5a和STAT5b介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生干擾[15]。我們通過對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行STAT5顯性負(fù)突變體轉(zhuǎn)染，使細(xì)胞過表達(dá)顯性負(fù)STAT5，從而減弱DNA結(jié)合活性，抑制EGF介導(dǎo)的DNA結(jié)合活性的增加，以此研究STA5活化后對(duì)COX-2的調(diào)節(jié)作用。通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行野生型STAT5的轉(zhuǎn)染可以使STAT5的表達(dá)升高，借助此方法，我們可以更深一步地為非磷酸化STAT5對(duì)COX-2的調(diào)控作用進(jìn)行闡釋。

本研究中，通過對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行EGF的刺激，STAT5 siRNA、野生型STAT5及STAT5顯性負(fù)突變體的轉(zhuǎn)染，從多層次多角度探討了STAT5對(duì)COX-2的調(diào)控作用，從而得出如下結(jié)論：EGF的刺激可誘導(dǎo)A549細(xì)胞中STAT5的活化，使COX-2 mRNA的表達(dá)明顯升高，但STAT5的表達(dá)未增加；STAT5 siRNA可抑制STAT5蛋白及COX-2 mRNA的表達(dá)，并可削減EGF對(duì)STAT5的激活效應(yīng)；野生型STAT5可使STAT5蛋白和COX-2 mRNA的表達(dá)升高，但不能使STAT5發(fā)生活化；STAT5顯性負(fù)突變體可削減EGF對(duì)STAT5的活化作用和EGF上調(diào)COX-2 mRNA的作用。這些結(jié)果提示，在肺腺癌A549細(xì)胞中，STAT5的激活參與了COX-2的調(diào)控，而且是COX-2上調(diào)表達(dá)的必須條件。另一方面，非磷酸化的STAT5的表達(dá)也是COX-2表達(dá)的必要條件，其可能通過不依賴于磷酸化和轉(zhuǎn)錄激活途徑來實(shí)現(xiàn)其調(diào)控作用。COX-2表達(dá)很可能受非磷酸化STAT5及磷酸化STAT5雙途徑的調(diào)控。據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道，STAT5可被EGFR家族激酶激活，這也與我們得出的STAT5可以通過EGFR信號(hào)通路發(fā)生活化這一結(jié)論相符。

圖 6 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型STAT5，STAT5顯性負(fù)突變體和STAT5 siRNA后以及受到EGF刺激后對(duì)STAT5 DNA結(jié)合力表達(dá)影響的分析。與其它組相比，*P＜0.05，n=3。Fig 6 STAT5 DNA binding assay in A549 cells nuclei transfected with WT-STAT5, DN-STAT5 and STAT5 siRNA with or without EGF stimulation.Data are means± SEM. *P＜0.05 when compared with the other four groups. n=3.

圖 7 STAT5對(duì)COX-2可能存在的兩種調(diào)控機(jī)制。STAT5通過磷酸化及非磷酸化雙途徑來實(shí)現(xiàn)對(duì)COX-2的調(diào)控。Fig 7 Schematic depiction of two different potential mechanisms of regulation. STAT5 regulates COX-2 by pathways dependent of phosphorylation and unphosphorylation.

綜上所述，通過我們研究，有如下新發(fā)現(xiàn)：①在體外A549細(xì)胞中STAT5無激活；②EGF能夠誘導(dǎo)STAT5的激活，促使磷酸化的STAT5穿梭入核；③STAT5的激活是EGF誘導(dǎo)COX-2上調(diào)表達(dá)的必要條件；④非磷酸化狀態(tài)的STAT5可能通過非轉(zhuǎn)錄激活的途徑參與了COX-2表達(dá)的調(diào)控。更令我們感興趣的是在研究中發(fā)現(xiàn)非磷酸化STAT5也可能參與了COX-2表達(dá)的調(diào)控，還有一個(gè)尚未明確的信號(hào)通路需要我們繼續(xù)去探求。我們可以利用STAT5通過磷酸化及非磷酸化雙途徑來實(shí)現(xiàn)對(duì)COX-2的調(diào)控（圖7）這一特點(diǎn)，探求一條以STAT5為靶點(diǎn)治療肺腺癌的新途徑，為更多肺腺癌患者的治療尋求到新出路。