何曉玲 / 福建省晉江市質(zhì)量計量檢測所

0 引言

甜蜜素（Sodium cyclamate）化學名稱為環(huán)己基氨基磺酸鈉，分子結(jié)構(gòu)式為C6H11NHSO3Na，是一種人工合成的甜味劑，味道清甜，甜度為蔗糖的40～50倍，為無營養(yǎng)甜味劑。作為人工合成甜味劑，甜蜜素被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，如飲料、蜜餞、糕點等食品中。由于有研究表明甜蜜素可能在腸菌作用下分解為有慢性毒性的環(huán)己胺，可能導致膀胱癌，所以美國、英國、加拿大、日本等國禁止使用甜蜜素作為食品添加劑，我國對甜蜜素的使用也有強制限量的規(guī)定[1]。

目前已建立的食品中甜蜜素檢測方法主要有：氣相色譜法[2，3]、比色法[4]、薄層層析法[5]、高效液相色譜法[6]、氣質(zhì)聯(lián)用法[7]、液質(zhì)聯(lián)用法[8]等。比色法和薄層層析法操作較為繁瑣且靈敏度不高，已基本不使用；氣相色譜法的衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，易分解，且保存條件苛刻；氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法操作簡單、檢出限低，但儀器昂貴，不適合作為基層檢驗機構(gòu)日?？焖贆z測使用方法；近年來液相色譜法檢測甜蜜素日益受到研究人員的關(guān)注并進行了相關(guān)報道，其衍生產(chǎn)物常溫下性質(zhì)穩(wěn)定，靈敏度高，檢出限低，儀器要求不高，檢測過程簡單方便，目前尚未見有關(guān)含乳飲料基質(zhì)中甜蜜素檢測方法的報道。本文通過優(yōu)化含乳飲料中甜蜜素液相檢測方法的前處理過程，建立了柱前衍生-高效液相色譜法分離檢測含乳飲料中甜蜜素的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器

2695高效液相色譜儀（美國waters公司），配有2998 PDA檢測器、四元泵、在線真空脫氣機、柱溫箱、自動進樣器；320R離心機（德國Hettich公司）；AXL阿修羅實驗室超純水機；0.45μm尼龍濾膜（津騰）。

1.2 試劑

甲醇，乙腈（HPLC級，沃凱）；其余試劑均為分析純，實驗用水為超純水。正己烷（國藥集團化學試劑有限公司）；乙酸鉛溶液（22 g/L），次氯酸鈉溶液（1 ： 1），硫酸溶液（1 ： 1）；碳酸氫鈉溶液（10%），氯化鈉（西隴化工股份有限公司）。

甜蜜素標準物質(zhì)（純度99.8%，北京上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究院）。

1.3 色譜分析條件

色譜柱：Waters SunFire C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇：水= 85 ： 15；檢測波長：311 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

1.4 樣品處理

稱取混勻后的含乳飲料樣品10 g，緩慢加入3.0 mL乙酸鉛溶液，搖勻，靜置30 min，6 000 rpm離心15 min后過濾，取上清液加入1.0 mL硫酸溶液，搖勻后加入2.0 mL次氯酸鈉溶液，振搖2 min，加入2 g氯化鈉和5.0 mL正己烷，振搖2 min后靜置分層，取正己烷層加入20.0 mL碳酸氫鈉溶液充分振搖，取正己烷層經(jīng)0.45 μm膜過濾后進液相色譜進行分析。

1.5 標準溶液制備

1.5.1 標準儲備液

準確稱取甜蜜素標準品100.0 mg溶于超純水并定容至100.0 mL容量瓶中，作為標準儲備液，濃度為1.0 mg/mL，臨用前用超純水稀釋。

1.5.2 標準工作溶液

使用前用超純水稀釋為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.50 mg/mL的標準工作溶液。

1.5.3 標準工作曲線測定

分別吸取10.0 mL甜蜜素標準工作溶液，加入1.0 mL硫酸溶液，搖勻后加入2.0 mL次氯酸鈉溶液，振搖2 min，加入2 g氯化鈉和5.0 mL正己烷，振搖2 min后靜置分層，取正己烷層加入20.0 mL碳酸氫鈉溶液充分振搖，分層后取正己烷層經(jīng)0.45 μm膜過濾后進液相色譜進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預(yù)處理方式選擇

甜蜜素穩(wěn)定性好，對熱、光、空氣、酸、堿均穩(wěn)定，不溶于乙醇、乙醚、苯和氯仿等，在水中的溶解度大，能達到200 g/kg。本實驗的樣品基質(zhì)是蛋白質(zhì)、固形物，食品添加劑豐富的含乳飲料，蛋白質(zhì)的大量存在影響衍生產(chǎn)物的萃取過程，產(chǎn)生大量難以消解的泡沫，萃取分層困難，所以在前處理方法中重點考察甜蜜素與蛋白質(zhì)、固形物等的分離。

本實驗選取乙酸鉛溶液、三氯乙酸溶液對樣液進行預(yù)處理，6 000 rpm離心15 min取上清，三氯乙酸溶液沉淀效果不佳，故排除。考察含乳飲料加標，經(jīng)乙酸鉛溶液前處理后，離心取上清液，按1.5.3 加入1.0 mL硫酸溶液等步驟進行檢測，選取乙酸鉛溶液作為樣品中蛋白質(zhì)及其他大分子極性物質(zhì)沉淀劑。其沉淀效果好、速度快、不影響目標產(chǎn)物回收率。

2.2 衍生化方法的優(yōu)化

衍生效率直接影響方法的回收率和精密度，故本實驗著重對甜蜜素的柱前衍生方法進行了優(yōu)化，主要考察衍生處理中的pH、衍生劑加入量、正己烷加入量、氯化鈉加入量、碳酸氫鈉加入量等參數(shù)對于衍生效果的影響。

2.2.1 pH

本實驗的衍生反應(yīng)是在強酸性條件下進行的，所以首先研究pH對衍生化效果的影響。取3份濃度為0.50 mg/mL的甜蜜素標準工作溶液10.0 mL，分別加入1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL硫酸溶液，按1.5.3方法進行檢測，由實驗結(jié)果可知當硫酸溶液加入量為1.0 mL時，已能滿足衍生反應(yīng)條件要求。

2.2.2 衍生劑加入量

本實驗的衍生劑是次氯酸鈉，故次氯酸鈉加入量直接影響到衍生反應(yīng)是否能進行得完全。取5份10.0 mL濃度為0.50 mg/mL的甜蜜素標準工作溶液，按1.5.3方法進行檢測，其中衍生劑加入量分別為0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL 次氯酸鈉溶液，實驗結(jié)果見圖1，表明衍生劑加入量為2.0 mL時已能滿足衍生反應(yīng)要求。

圖1 衍生劑加入量

2.2.3 正己烷加入量

本實驗的萃取溶劑是正己烷，取4份10.0 mL濃度為0.50 mg/mL的甜蜜素標準工作溶液，按1.5.3方法進行檢測，其中正己烷的加入量分別為2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL，理論上正己烷的加入量應(yīng)與響應(yīng)值成反比，研究結(jié)果見圖2，表明當正己烷加入量＜5.0 mL時，響應(yīng)值不成比例增加，說明萃取效率降低。當正己烷加入量≥5.0 mL時，響應(yīng)值隨著正己烷加入量的增加成比例減少，表明正己烷加入量為5.0 mL時已能滿足萃取衍生物的要求。若要減少正己烷用量，可用增加萃取次數(shù)來提高衍生物提取效率。

圖2 正己烷加入量

2.2.4 氯化鈉加入量

反應(yīng)中加入氯化鈉是為了增加鹽析，改善衍生物N，N-二氯環(huán)己胺在水相和有機相的分布，提高萃取效率。實驗考察了氯化鈉在衍生反應(yīng)前添加、在反應(yīng)后添加和不添加三種情況，取3份10.0 mL濃度為0.50 mg/mL的甜蜜素標準工作溶液，按1.5.3方法進行檢測，結(jié)果表明在衍生反應(yīng)后添加再進行萃取既不影響衍生反應(yīng)產(chǎn)物的生成又能提高反應(yīng)效率。

2.2.5 碳酸氫鈉加入量

衍生反應(yīng)萃取后，用10%碳酸氫鈉溶液對正己烷層進行洗滌的目的是為了中和過量的硫酸溶液和次氯酸鈉溶液，保護液相色譜管路和液相色譜柱的使用壽命。實驗對此進行了研究，結(jié)果表明碳酸氫鈉溶液加入量為15.0 mL時已能滿足實驗要求。

2.2.6 優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)過實驗優(yōu)化，確定最佳的衍生化條件為：硫酸溶液加入量為1.0 mL，次氯酸鈉溶液加入量為2.0 mL，正己烷加入量為5.0 mL，氯化鈉在衍生反應(yīng)后添加再進行萃取，碳酸氫鈉溶液加入量為15.0 mL。以下實驗均按照最優(yōu)化結(jié)果進行。

2.3 儀器方法的選擇

2.3.1 測定波長

甜蜜素在酸性條件下經(jīng)次氯酸鈉衍生，正己烷萃取的衍生物為N，N-二氯環(huán)己胺，對其在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行全波長光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在205.3 nm和311.8 nm處有強吸收峰，考慮到210 nm處流動相中的甲醇和許多雜質(zhì)在此有強吸收干擾，故選擇311 nm為檢測波長（圖3）。

圖3 衍生物N，N-二氯環(huán)己胺紫外吸收光譜圖

2.3.2 流動相

流動相對樣品的分離有很大影響，實驗比較了甲醇-水、乙腈-水兩種流動相體系的分離效果，實驗結(jié)果表明兩者無明顯差別；實驗考察0.02 mol/L乙酸銨代替水作為緩沖溶液對分離效果的影響，結(jié)果表明未見明顯差別，不影響色譜峰形，故測定時選用甲醇-水體系并通過實驗確定甲醇-水的配比為85 ： 15，甜蜜素衍生物的液相色譜圖見圖4。

圖4 甜蜜素衍生物N，N-二氯環(huán)己胺液相色譜圖

2.4 標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)

將1.5.2中制備好的甜蜜素標準工作溶液按2.2.6方法進行衍生化， HPLC測定，對峰面積和甜蜜素的質(zhì)量濃度進行線性回歸，結(jié)果可知，甜蜜素在0.01～0.50 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 4。

本方法對含乳飲料中甜蜜素測定的最低檢出限為0.5 mg/kg。

2.5 回收率和精密度實驗

采用含乳飲料基質(zhì)添加甜蜜素標樣進行回收率實驗，所用的含乳飲料的本底不含甜蜜素的陰性樣品，分別添加20 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg，按照2.2.6方法進行衍生化，HPLC進行甜蜜素含量測定，計算甜蜜素回收率，每個水平進行n = 6次重復試驗，計算平均回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表1，測定實際樣品的液相色譜見圖5。

表1 方法精密度和回收率實驗結(jié)果（n=6）

圖5 N，N-二氯環(huán)己胺液相色譜圖

2.6 穩(wěn)定性測試

將N，N-二氯環(huán)己胺的正己烷提取物放置于室溫（20～25℃）和冰箱（4℃）保存，第1 d、3 d、6 d分別測定其峰面積，響應(yīng)值均未見明顯變化，說明N，N-二氯環(huán)己胺在室溫及（20～25℃）和冰箱（4℃）條件下是穩(wěn)定的。

3 結(jié)語

本文針對市售的含乳飲料進行了前處理研究，對甜蜜素進行了衍生化、萃取過程的優(yōu)化，建立了含乳飲料中快速檢測甜蜜素的高效液相色譜分析定量方法，衍生產(chǎn)物常溫下穩(wěn)定，檢出限低，方法精密度、回收率高，均符合日常檢測要求，對于其他基質(zhì)復雜的產(chǎn)品檢驗有借鑒價值。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 2760-2011 [S]. 北京：中國標準出版社，2011.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部. GB/T 5009.97-2003 [S]. 北京：中國標準出版社，2003.

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