孫保東 蔡文虹 洪小平 劉冬舟 黃 勤 譚艷紅

暨南大學(xué)第二附屬醫(yī)院 深圳市人民醫(yī)院風(fēng)濕科，廣東深圳 518020

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種典型的異質(zhì)性自身免疫病，主要表現(xiàn)為自身反應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞過度激活以及多種自身抗體（主要是抗核抗體）的產(chǎn)生，循環(huán)免疫復(fù)合物沉積或形成，導(dǎo)致多個系統(tǒng)器官損傷等。但SLE病因和免疫耐受紊亂機(jī)制等尚未闡明。

轉(zhuǎn)化生長因子 β（transforming growth factorβ，TGFβ）是一種重要的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，在人類中可分為TGFβ1～3，其中最重要的是 TGFβ1[1]。 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg）是一種參與自身抗原外周耐受和外來抗原免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的主要調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群，對維持外周免疫耐受有重要意義[2]。研究表明兩者功能上存在著密切聯(lián)系，如TGFβ可以促使幼稚T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化成熟，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可通過分泌TGFβ發(fā)揮免疫抑制作用等[3]。因此，TGFβ和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分別在細(xì)胞因子和細(xì)胞水平上對維持機(jī)體免疫平衡、免疫耐受等起重要作用，兩者數(shù)量或功能缺陷均可能導(dǎo)致或加重自身免疫病的發(fā)生發(fā)展[1-2]。

已有研究顯示，SLE患者TGFβ和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)和功能異常[4～8]，但結(jié)果不統(tǒng)一。為探索SLE免疫紊亂機(jī)制，本文對SLE患者血清TGFβ1和外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行檢測，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選擇2011年6月～2012年9月本院風(fēng)濕科門診及住院SLE患者，均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)SLEDAI積分法分為活動組（≥10分）和穩(wěn)定組（＜10分）。正常對照組為本院體檢女性，體檢結(jié)果無明顯異常且年齡與SLE組患者相匹配。

1.2 血清 TGFβ1檢測

所有受試者晨起空腹干燥管抽取靜脈血2 ml，離心取血清，-80℃保存。采用ELISA法集中檢測血清TGFβ1水平，采用美國R＆D公司TGFβ1檢測試劑盒，操作按說明書。

1.3 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測法，取受試者100 μl抗凝靜脈血，分別加入10 μl PE標(biāo)記鼠抗人CD25單抗和FITC標(biāo)記鼠抗人CD4單抗（均美國BD公司），室溫避光放置30 min，再加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，室溫避光10 min，2000 r/min低溫離心5 min，棄上清，PBS 2 ml洗滌2次后再加入0.5 ml PBS重懸，EPILS-ALTRA型流式細(xì)胞分析儀（美國庫爾特公司）檢測，EXPO2軟件分析。據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光以淋巴細(xì)胞群設(shè)門，測定標(biāo)本CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞百分率；以單個細(xì)胞抗CD25熒光強(qiáng)度≥10設(shè)為CD25high細(xì)胞，計(jì)算CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分率。

1.4 其他抗體檢測

抗核抗體（ANA）采用間接免疫熒光法測定，抗可抽提核抗原抗體（ENA）采用免疫印跡法測定，抗雙鏈DNA抗體（ds-DNA抗體）采用放射免疫法測定，血清補(bǔ)體C3、C4采用免疫比濁法測定等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SLE患者血清TGFβ1的表達(dá)水平

SLE活動組患者TGFβ1表達(dá)明顯低于正常對照組和穩(wěn)定組患者（P<0.01），而穩(wěn)定組和正常對照組TGFβ1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表 1）。

表1 SLE患者與對照組血清TGFβ1表達(dá)水平的比較（±s）

表1 SLE患者與對照組血清TGFβ1表達(dá)水平的比較（±s）

與正常對照組和穩(wěn)定組比較，*P<0.01

組別 n年齡（歲） TGFβ1（pg/ml）正常對照組SLE組活動組穩(wěn)定組20 55 23 32 35.8±12.0 36.5±14.0 35.6±12.5 37.4±14.6 1314±129 1191±458 715±414*1423±153

2.2 SLE患者CD4+CD25+、CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)

活動SLE患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分率均低于正常對照組和穩(wěn)定組患者（均P＜0.05），而穩(wěn)定組SLE與正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 SLE患者外周血CD4+CD25+、CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分率（%，±s）

表2 SLE患者外周血CD4+CD25+、CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分率（%，±s）

與正常對照組和SLE穩(wěn)定組比較，*P＜0.05

組別 n年齡（歲，±s）CD4+CD25+ CD4+CD25high CD4+ CD4+中CD25+正常對照組SLE組活動組穩(wěn)定組20 38 15 23 36.0±8.5 36.4±9.4 35.3±6.5 37.1±8.4 8.78±2.87 8.5±3.4 4.53±0.85*10.89±1.41 1.88±0.64 1.63±1.2 0.87±0.5*2.09±1.28 34.75±6.35 29.68±8.03 21.5±5.13*34.58±4.64 18.53±4.6 18.59±6.0 16.13±4.47 20.06±6.53

2.3 相關(guān)性分析

SLE患者TGFβ1表達(dá)、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)均與狼瘡活動度SLEDAI積分成負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與病程、免疫球蛋白、補(bǔ)體、抗ds-DNA量等未見明顯相關(guān)性（均P>0.05）（表3）。15例患者同時檢測TGFβ1和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)，兩者之間未見明顯相關(guān)性（r=0.51，P=0.113）。 此外，SLE 患者血清 TGFβ1表達(dá)與外周血小板數(shù)量和血紅蛋白量成正相關(guān)（r=0.71，P=0.001 和 r=0.44，P=0.042）。

3 討論

TGFβ是一種重要的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子，可作用于免疫系統(tǒng)的各個環(huán)節(jié)，如抑制免疫活性細(xì)胞的增殖和分化，抑制細(xì)胞因子和抗體產(chǎn)生等。TGFβ表達(dá)或功能異常與自身免疫病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如敲除TGFβ1基因老鼠臨床表現(xiàn)與人SLE、干燥綜合征極其類似[1]。本文檢測結(jié)果顯示，活動SLE血清TGFβ1水平明顯下降，并且與疾病活動度呈負(fù)相關(guān)，而穩(wěn)定期患者表達(dá)水平不低，這與多數(shù)報(bào)道結(jié)果一致[4-6]，提示TGFβ1表達(dá)可能參與SLE發(fā)病或促進(jìn)病情活動，并可能有助于臨床判斷疾病活動度等。然而TGFβ1表達(dá)與其他臨床指標(biāo)如抗ds-DNA量、24 h尿蛋白定量、補(bǔ)體等未見明顯相關(guān)性，提示TGFβ可能只是SLE發(fā)病的一個因素?；顒覵LE患者血清TGFβ1表達(dá)減少可能主要與外周血單個核細(xì)胞尤其是NK細(xì)胞產(chǎn)生TGFβ能力下降有關(guān)[1，4]。其次，發(fā)現(xiàn)患者TGFβ1水平與血小板數(shù)量成正相關(guān)，而活動SLE患者血小板常減少，這可能也是血清TGFβ1減少的一個原因。

表3 SLE患者TGFβ1、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種最主要的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，即高表達(dá)CD25和Foxp3的CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群。研究顯示，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可對多種免疫細(xì)胞發(fā)揮抑制效應(yīng)，如調(diào)控B細(xì)胞產(chǎn)生抗體等[9]，在維持機(jī)體自身耐受和自身免疫疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[2]。近期研究顯示，多發(fā)性硬化[10]、哮喘[11]、特發(fā)性血小板減少性紫癜[12]等發(fā)病均與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞異常有關(guān)。本研究顯示，活動SLE患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)減少，而穩(wěn)定期患者與正常對照無差別，這與國內(nèi)外報(bào)道結(jié)果基本一致[6-8]。有研究認(rèn)為在人類外周血有免疫抑制活性的主要是CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，本文以熒光強(qiáng)度≥10定義CD25high細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)活動性患者CD4+CD25high也是降低的，并且與SLEDAI積分負(fù)相關(guān)，這均提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能參與SLE發(fā)病，并且可能和病情活動有關(guān)。但相關(guān)分析未發(fā)現(xiàn)外周血CD4+CD25+和CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)與其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性，說明它們可能沒有直接參與SLE臨床病理和臨床表型等。不過，國內(nèi)有學(xué)者報(bào)道CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等與狼瘡腎炎[13]、狼瘡中醫(yī)辨證分型[14]等相關(guān)，但本文并未發(fā)現(xiàn)狼瘡患者蛋白尿或血尿與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)性?；顒悠赟LE患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少的原因有待進(jìn)一步闡明。早期有研究表明，SLE患者外周血CD4+細(xì)胞減少與病情活動相關(guān)，其減少可能與抗體所致破壞和凋亡過多有關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比率與正常對照無差異，并且與CD4+T細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少可能主要是由于CD4+T細(xì)胞減少所致。因此，設(shè)法提高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量和功能可能是SLE治療的重要新方法。已有研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可以促進(jìn)TGFβ1誘導(dǎo)分化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖，且具有免疫抑制功能，這為體外回輸調(diào)節(jié)性T細(xì)胞治療自身免疫病提供了可能[16]。

TGFβ和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能可能存在密切聯(lián)系，已有研究表明，TGFβ1不僅是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分泌因子，它更能調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化和功能[2-3]，而SLE患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌TGFβ異常[5，8]。本文對部分患者同時檢測TGFβ1和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)，但未發(fā)現(xiàn)兩者之間明顯相關(guān)，這與陳偉等[4]報(bào)道一致，提示其表達(dá)可能受多種因素影響，功能上可能存在相對獨(dú)立性。當(dāng)然，也不排除例數(shù)少對統(tǒng)計(jì)結(jié)果的影響，必要時擴(kuò)大樣本數(shù)等深入研究其相互作用。此外，F(xiàn)oxp3基因表達(dá)對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞形成和功能維持起重要作用，SLE患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能有無異常以及與TGFβ表達(dá)調(diào)控的關(guān)系等有待進(jìn)一步研究。

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