李澤兵,劉常敬,趙白航,馬家軒,王曉毅,李 軍* (.北京工業(yè)大學(xué)北京市水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 004；.河南省化工研究所有限責(zé)任公司,河南 鄭州 5080)

近年來(lái),短程反硝化技術(shù)有了較大的發(fā)展,以亞硝氮為底物的自養(yǎng)厭氧氨氧化[1-4]和異養(yǎng)反硝化[5-6]研究越來(lái)越多.相對(duì)于自養(yǎng)硝化菌,以硝氮和亞硝氮為底物的異養(yǎng)反硝化菌在污水處理構(gòu)筑物中具有更好的種群多樣性并且易于培養(yǎng)馴化,當(dāng)然,對(duì)于不同的反硝化碳源,其反硝化優(yōu)勢(shì)菌群和活性也有一定的差異.而厭氧氨氧化過(guò)程不需要有機(jī)碳源,因此在處理低碳氮比污水中具有顯著的優(yōu)勢(shì).雖然自養(yǎng)厭氧氨氧化菌(AAOB)生長(zhǎng)緩慢,但是在長(zhǎng)期培養(yǎng)后就可獲得極快的反應(yīng)速率和在總菌量中占據(jù)較大的優(yōu)勢(shì),大量研究表明,厭氧氨氧化顆粒污泥反應(yīng)器或者生物膜反應(yīng)器中都能實(shí)現(xiàn)較高的脫氮效率[1,7-9].

無(wú)論是前置厭氧氨氧化還是后置厭氧氨氧化,待處理水中有機(jī)物總是或多或少的存在,因此,厭氧氨氧化發(fā)展始終在探索厭氧氨氧化菌和各種有機(jī)物以及異養(yǎng)反硝化菌之間的關(guān)系[10-13],以建立一個(gè)不受有機(jī)物影響甚至能夠較好的利用有機(jī)物的高效厭氧氨氧化反應(yīng)器.

將異養(yǎng)反硝化菌和自養(yǎng)AAOB混合培養(yǎng),可使AAOB在相對(duì)較高有機(jī)物濃度條件下保持活性穩(wěn)定,在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中更具有優(yōu)勢(shì).本研究選取甲醇反硝化菌,城市污水處理廠活性污泥和厭氧氨氧化顆粒污泥進(jìn)行研究.在亞硝氮和氨氮同時(shí)存在的基質(zhì)中,分別在污泥和各種有機(jī)物混合,自養(yǎng)和異養(yǎng)反硝化菌群混合條件下開(kāi)展反硝化研究,比較了異養(yǎng)和自養(yǎng)反硝化的效果.在此多基質(zhì),多種群條件下探明有機(jī)物和異養(yǎng)反硝化菌對(duì)自養(yǎng)AAOB的作用機(jī)理,為建立高效厭氧氨氧化反應(yīng)器提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 污泥來(lái)源

1.1.1 AAOB AAOB來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室厭氧氨氧化固定床反應(yīng)器下部的懸浮污泥(圖1),刻度尺所示最小刻度為1mm.厭氧氨氧化固定床反應(yīng)器有效容積 50L,原水中亞硝氮控制為 50～60mg/L,氨氮為 40～50mg/L,其余組分和微量元素控制參照文獻(xiàn)10.反應(yīng)器溫度為24～26℃,進(jìn)水由濃水和未經(jīng)消氧的自來(lái)水組成,DO為 4～5mg/L.取樣期反應(yīng)器 HRT為 3h,總氮平均容積去除負(fù)荷為 0.5kg/(m3?d),懸浮污泥 MLVSS/MLSS 為 56%～58%,總氮平均比降解速率0.312kg/(kg·d).污泥取出后,清水清洗3遍后備用.

圖1 AAOB顆粒Fig.1 Granular sludge of AAOB

1.1.2 甲醇反硝化菌 甲醇反硝化菌是在 5L的有機(jī)玻璃圓柱中培養(yǎng)馴化的,其中投加了堆積體積為 3L的環(huán)狀辮帶式載體.馴化開(kāi)始時(shí),接種污泥取自高碑店污水處理廠二沉池回流污泥廊道取樣點(diǎn).整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程均為反應(yīng)器底部連續(xù)進(jìn)水,上部自流出水,HRT為 4.8h,進(jìn)水亞硝氮 50～60mg/L,甲醇(200±20)mg/L,溫度為室溫 20～25℃.培養(yǎng) 40d后,亞硝氮容積去除負(fù)荷達(dá)到0.2kg/(m3·d).活性分析試驗(yàn)前,將載體取出,用清水將污泥從載體上洗脫,洗脫污泥再用清水清洗3遍后備用.

1.1.3 活性污泥 試驗(yàn)用活性污泥取自高碑店污水處理廠二沉池回流污泥廊道取樣點(diǎn).取回后清水清洗3遍后備用.

1.2 試驗(yàn)裝置和程序

試驗(yàn)所用試驗(yàn)裝置如圖 2所示.反應(yīng)瓶容積為 500mL,有效容積 450mL(150mL備用污泥+300mL由自來(lái)水和試劑配置的試驗(yàn)用水).試驗(yàn)步驟:(1)配置泥水混合液,測(cè)定pH值和MLSS;(2)啟動(dòng)恒溫磁力攪拌器,轉(zhuǎn)速為 300r/min,溫度(25±1)

℃,通氮?dú)?30min(氮?dú)饧兌?99.999%);(3)停止通氮?dú)?依據(jù)反應(yīng)速率,每隔1h或0.5h取樣一次,每次取樣體積 2mL;(4)試驗(yàn)結(jié)束,停止攪拌器,測(cè)定pH值和MLSS.

圖2 反應(yīng)裝置示意Fig.2 Schematic diagram of the denitrification reactor

1.3 試驗(yàn)水質(zhì)

試驗(yàn)用水采用配水,亞硝氮為40～60mg/L,氨氮為 40～60mg/L,其余組分和微量元素控制參照文獻(xiàn)[10].不同有機(jī)物影響試驗(yàn)時(shí),醇類和其他有機(jī)物每次的投量分別為0.1mL和0.1g.

1.4 分析方法

水質(zhì)指標(biāo)NO2--N, NH3-N, MLSS和MLVSS等,均采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法分析.pH值測(cè)量采用Thermo scientific pH計(jì).

2 結(jié)果與討論

2.1 不同有機(jī)物存在時(shí)AAOB的活性

試驗(yàn)選取醇類(甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇)、乙酸鈉、丙酸鈉、糖類(葡萄糖、乳糖和蔗糖)等常見(jiàn)有機(jī)物,考察各有機(jī)物存在時(shí) AAOB的活性,其中,各試驗(yàn)投加有機(jī)物后,有機(jī)物濃度為200mg/L.從圖3可以看出,各條件下氨氮和亞硝氮的降解過(guò)程均為零級(jí)反應(yīng),線性擬合較好.

如表1和圖3所示,當(dāng)醇類有機(jī)物投量約為175.56mg/L(甲醇、乙醇、正丙醇和正丁醇分別為 5.48,3.81,2.92,2.37mmol/L)時(shí),AAOB降解亞硝氮和氨氮的總體活性損失接近 50%,其中甲醇導(dǎo)致的總體活性損失最大,乙醇次之,正丁醇活性損失略大于正丙醇.如表1所示,在各反應(yīng)條件下,反應(yīng)器中自養(yǎng)和異養(yǎng)反硝化過(guò)程均同時(shí)存在,只是由于添加不同有機(jī)物,各反應(yīng)速率差異較大.由于試驗(yàn)過(guò)程沒(méi)有好氧硝化,因此以氨氮降解評(píng)價(jià)自養(yǎng)厭氧氨氧化活性,然后基于化學(xué)計(jì)量學(xué)方法,總的亞硝氮降解速率減去相應(yīng)的自養(yǎng)亞硝氮降解速率,剩余亞硝氮降解速率即可表征異養(yǎng)反硝化速率.因此可得出甲醇為5.48mmol/L時(shí),AAOB自養(yǎng)活性為原有活性的 1/3.Isaka等[14]的研究表明甲醇為 5.0mmol/L條件下,游離和聚乙烯醇包埋 AAOB活性分別為原有活性的 37%和 33%,與本試驗(yàn)結(jié)果較接近.隨著醇類碳鏈的增加,與自養(yǎng)活性逐漸上升恰恰相反,異養(yǎng)反硝化活性逐漸降低,4種醇類有機(jī)物中,AAOB富集培養(yǎng)物利用甲醇和乙醇進(jìn)行異養(yǎng)反硝化的能力顯著高于正丙醇和正丁醇.

如表1和圖3所示,丙酸鈉、葡萄糖、乳糖和蔗糖對(duì) AAOB活性的影響較小,結(jié)果類似于Güven等[12]的研究. Kartal等[15]將能同時(shí)厭氧氨氧化和利用丙酸鈉反硝化的 AAOB命名為Anammoxoglobus propionicus,揭示了在小分子有機(jī)酸存在條件下AAOB的代謝途徑具有多樣性.如表1所示,本實(shí)驗(yàn)所用的AAOB在乙酸鈉存在時(shí)活性上升了27.05%,而丙酸鈉存在時(shí)未發(fā)現(xiàn)活性上升,其差別應(yīng)和 AAOB的種類密切相關(guān).Kartal等[15]的研究表明,在丙酸鈉、氨氮、亞硝氮和硝氮同時(shí)存在時(shí),Anammoxoglobus propionicus以亞硝氮和硝氮為電子受體,可將丙酸鈉氧化,并且不直接利用丙酸合成菌體.但是,Kartal等[16]關(guān)于Brocadia fulgida適于含乙酸鈉廢水的研究中,再未描述相關(guān)的反硝化過(guò)程.

圖3 多基質(zhì)環(huán)境中AAOB對(duì)亞硝氮和氨氮的降解Fig.3 Nitrite and ammonium conversion in multi-matrixes by AAOB

2.2 甲醇反硝化菌和活性污泥的活性和對(duì)碳源的適應(yīng)性

在工業(yè)水處理中,甲醇被廣泛用作反硝化碳源[17-19].通常情況下,反硝化菌須經(jīng)過(guò)馴化后,才能較好利用甲醇.如圖4和表2所示,馴化后的甲醇反硝化菌利用甲醇短程反硝化時(shí)的亞硝氮比降解速率最大為0.251 kg/(kg·d),利用乙醇、正丙醇和乙酸鈉時(shí),其速率分別為最大比降解速率的95%、85%和43%.葡萄糖則很難被其反硝化利用,速率僅為最大比降解速率的16%.

表1 不同碳源條件下AAOB的活性Table 1 Activity and details of AAOB under different organic matrixes

圖4 不同碳源時(shí)甲醇反硝化菌對(duì)亞硝氮的降解曲線Fig.4 Nitrite conversion in different matrixes by methanol denitrifiers

北京市高碑店污水處理廠采用廊道式 A/O工藝處理城市生活污水,其活性污泥具有較好的硝化和反硝化能力.如圖5和表3所示,在批式試驗(yàn)中,活性污泥利用乙酸鈉短程反硝化的能力強(qiáng)于其他幾種碳源,其亞硝氮比降解速率為0.128kg/(kg·d),其后依次為乙醇、甲醇和葡萄糖,乳糖最差.

甲醇反硝化菌和活性污泥的活性主要取決于菌群中反硝化菌的種類和數(shù)量.在以甲醇為碳源長(zhǎng)期運(yùn)行的系統(tǒng)中,選擇性增殖的甲醇反硝化菌可將醇類轉(zhuǎn)化為乙酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)以獲得反硝化所需的能量和電子供體[20],因此,在乙醇和正丙醇作為碳源時(shí)也能獲得較好的反硝化效果.由于乙酸和葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞膜需要載體蛋白,而甲醇反硝化菌缺乏相應(yīng)的蛋白,從而導(dǎo)致其進(jìn)入細(xì)胞膜較困難,所以反硝化效果較差.活性污泥所在的城市污水處理系統(tǒng)中,由于有機(jī)物種類較豐富,有利于各類反硝化菌的生長(zhǎng)繁殖,因此活性污泥在各有機(jī)物存在時(shí)均有一定的反硝化效果.另外,從表2和表3可以看出,活性污泥利用乙酸鈉和葡萄糖反硝化的活性略高于甲醇反硝化菌,而利用醇類碳源反硝化的能力遠(yuǎn)小于甲醇反硝化菌.

圖5 不同碳源時(shí)活性污泥對(duì)亞硝氮的降解曲線Fig.5 Nitrite conversion in different matrixes by activity sludge

表2 不同碳源條件下甲醇反硝化菌的活性Table 2 Activity and details of methanol denitrification enrichment under different organic matrixes

表3 不同碳源條件下活性污泥的活性Table 3 Activity and details of domestic wastewater treatment sludge under different organic matrixes

2.3 混合菌群的活性

試驗(yàn)將甲醇反硝化菌和活性污泥菌群分別與AAOB按比例混合.試驗(yàn)開(kāi)始時(shí),AAOB和甲醇反硝化菌混合菌群投加有機(jī)物正丙醇 0.1mL,AAOB和活性污泥中投加乙酸鈉0.1g.試驗(yàn)以氨氮的降解速率評(píng)價(jià)AAOB活性.

如圖6所示,AAOB和甲醇反硝化菌混合后,氨氮和亞硝氮降解均表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系,即氨氮和亞硝氮的降解與其濃度無(wú)關(guān),而與細(xì)胞活性和數(shù)量相關(guān).由表4可知,相對(duì)于未投加正丙醇的AAOB菌群活性,投加正丙醇導(dǎo)致AAOB活性損失接近 50%,并且隨著甲醇反硝化菌投加比例升高,AAOB活性下降趨勢(shì)愈發(fā)顯著,最大活性損失超過(guò)90%.說(shuō)明AAOB在醇類有機(jī)物存在的情況下不僅活性明顯下降,而且在與其他異養(yǎng)反硝化菌的競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì).

如圖7所示,AAOB和活性污泥混合后,氨氮和亞硝氮降解仍為線性關(guān)系.從圖 7和表 5可以看出,AAOB的活性未受到乙酸鈉的抑制,相反具有促進(jìn)作用.隨著活性污泥投加比例升高,AAOB活性仍有下降,但與第一組試驗(yàn)相比,AAOB活性下降趨勢(shì)顯著減弱,最大活性損失僅為 26.54%.因此,在以小分子有機(jī)酸為反硝化碳源,但是碳源不足以滿足反硝化脫氮的系統(tǒng)中,營(yíng)造AAOB和異養(yǎng)反硝化菌共存的單級(jí)脫氮反應(yīng)器具有較高的可行性.

表4 AAOB和甲醇反硝化菌混合后的活性Table 4 Activity and details of AAOB and methanol denitrifiers mixture under different organic matrixes

表5 AAOB和活性污泥混合后的活性Table 5 Activity and details of AAOB and activity sludge mixture under different organic matrixes

圖6 AAOB和甲醇反硝化菌混合存在時(shí)氨氮和亞硝氮的降解曲線Fig.6 Nitrite and ammonium conversion by AAOB and methanol denitrifiers mixture

3 結(jié)論

3.1 在多種基質(zhì)存在條件下,甲醇導(dǎo)致的AAOB 活性損失最大為 47.82%,乙醇次之,正丁醇活性損失略大于正丙醇.隨著醇類碳鏈的增加,與氨氮比降解速率逐漸上升恰恰相反,亞硝氮比降解速率最大下降了 22.43%.非醇類有機(jī)物中,乙酸鈉提高了AAOB活性27.05%,而丙酸鈉、葡萄糖、乳糖和蔗糖等對(duì)AAOB活性的影響較小,葡萄糖表現(xiàn)出最大的抑制作用也僅為6.49%.

3.2 經(jīng)馴化的甲醇反硝化菌,以甲醇為短程反硝化基質(zhì)時(shí)短程反硝化的亞硝氮比降解速率最大為 0.251kg/(kg·d),以乙醇、正丙醇和乙酸鈉為反硝化基質(zhì)時(shí)時(shí),速率分別為甲醇為基質(zhì)時(shí)的95%、85%和 43%.葡萄糖則很難被其利用.由于活性污泥中的反硝化細(xì)菌可直接利用乙酸鈉合成乙酰輔酶A參與三羧酸循環(huán),以獲得反硝化所需的能量及電子,因此活性污泥利用乙酸鈉短程反硝化的能力優(yōu)于甲醇、乙醇和葡萄糖等其它有機(jī)物.

3.3 在正丙醇存在條件下,AAOB和甲醇反硝化菌混合菌群中AAOB活性下降超過(guò)90%,在與甲醇反硝化菌的競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì).在乙酸鈉存在條件下,AAOB和活性污泥的混合菌群中AAOB活性損失較小,僅為26.54%.

[1]Mulder A, Vande Graaf A A, Robertson L A, et al. Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor [J]. FEMS Microbiology Ecology, 1995,16(3):177-183.

[2]Schouten S, Strous M, Kuypers M M M, et al. Stable carbon isotopic fractionations associated with inorganic carbon fixation by anaerobic ammonium oxidizing bacteria [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004,70(6):3785-3788.

[3]Strous M, Pelletier E, Mangenot S, et al. Deciphering theevolution and metabolism of an anammox bacterium from a community genome [J]. Nature, 2006,440(7085):790-793.

[4]Jetten M S M, Niftrik LV, Strous M, et al. Biochemistry and molecular biology of anammox bacteria [J]. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2009,44(2/3):65-84.

[5]Torà J A, Baeza J A, Carrera J, et al. Denitritation of a high-strength nitrite wastewater in a sequencing batch reactor using different organic carbon sources [J]. Chemical Engineering Journal, 2011,172(2/3):994-998.

[6]Jin X, Wang F, Liu G, et al. Characteristics of denitrifying granular sludge grown on nitrite medium in an upflow sludge blanket (USB) reactor [J]. Water Science and Technology, 2012,65(8):1420-1427.

[7]Tsushima I, Ogasawara Y, Kindaichi T, et al. Development of high-rate anaerobic ammonium-oxidizing (ANAMMOX) bio fi lm reactors [J]. Water Research, 2007(41):1623-1634.

[8]Tang C J, Zheng P, Wang C H, et al. Suppression of anaerobic ammonium oxidizers under high organic content in high-rate ANAMMOX UASB reactor [J]. Bioresource Technology, 2010,101:1762-1768.

[9]Abma W R, Schultz C E, Mulder J W, et al. Full-scale granular sludge ANAMMOX process [J]. Water Science and Technology,2007,55(8/9):27-33,524.

[10]van de Graaf AA, deBruijn P, Robertson L A, et al. Autotrophic growth of anaerobic ammonium -oxidizing micro-organisms in a fl uidized bed reactor [J]. Microbiology, 1996,142:2187-2196.

[11]Toh S K, Ashbolt N J. Adaptation of anaerobic ammoniumoxidising consortium to synthetic coke-ovens wastewater [J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2002,59(2/3):344-352.

[12]Güven D, Ana Dapena, Kartal B, et al. Propionate oxidation by and methanol inhibition of anaerobic ammonium?oxidizing bacteria [J]. Apply Environment Microbiology, 2005,71(2),1066-1071.

[13]González-Blanco G, Beristain-Cardoso R, Cuervo-López F, et al.Simultaneous oxidation of ammonium and p-cresol linked to nitrite reduction by denitrifying sludge [J]. Bioresource Technology, 2012,103(1),48-55.

[14]Isaka Kazuichi, Suwa Yuichi, Kimura Yuya, et al. Anaerobic ammonium oxidation (anammox) irreversibly inhibited by methanol [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008,81(2):379-385.

[15]Kartal B, Rattray J, van Niftrik L A, et al. Candidatus‘Anammoxoglobus propionicus’ a new propionate oxidizing species of anaerobic ammonium oxidizing bacteria [J]. System Apply Microbiology, 2007,30(1):39-49.

[16]Kartal B, van Niftrik L, Rattray J, et al. Candidatus ‘Brocadia fulgida’: an auto fl uorescent anaerobic ammonium oxidizing bacterium [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2008,63(1):46-55.

[17]Ginige Maneesha P, Bowyer Jocelyn C, Foley Leah, et al. A comparative study of methanol as a supplementary carbon source for enhancing denitrification in primary and secondary anoxic zones [J]. Biodegradation, 2009,20(2):221-234.

[18]Kim I S, Oh S E, Bum M S, et al. Monitoring the denitrification of wastewater containing high concentrations of nitrate with methanol in a sulfur-packed reactor [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002,59(1):91-96.

[19]Baytshtok Vladimir, Kim Sungpyo, Yu Ran, et al. Molecular and biokinetic characterization of methylotrophic denitrification using nitrate and nitrite as terminal electron acceptors [J]. Water Science and Technology, 2008,58(2):359-365.

[20]Weijma J, Stams A J M. Methanol conversion in high-rate anaerobic reactors [J]. Water Science and Technology, 2001,44(8):7-14.