楊蘇文,徐范范,趙明東 (中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院湖泊生態(tài)環(huán)境研究中心,環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100012)

四溴雙酚 A(TBBPA)是世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用的溴代阻燃劑,主要通過(guò)塑料和電子產(chǎn)品的制造與加工處置和循環(huán)利用過(guò)程進(jìn)入環(huán)境[1],目前已在土壤、水體、沉積物和大氣等環(huán)境介質(zhì)以及人體內(nèi)檢測(cè)到[2-8].TBBPA的水環(huán)境暴露水平日益升高,對(duì)水生生物具有潛在毒害影響.

環(huán)境污染物對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)是進(jìn)行毒性效應(yīng)研究及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ).鯽魚(yú)是分布于我國(guó)大部分地區(qū)的經(jīng)濟(jì)性魚(yú)類(lèi),為本土物種,對(duì)TBBPA毒性效應(yīng)及生態(tài)系統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究具有廣泛代表性,目前已被普遍應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)方面的研究,但有關(guān) TBBPA在魚(yú)體中組織分布和富集效應(yīng)的研究還較鮮見(jiàn)[9].因此本研究以鯽魚(yú)(Carassius auratus)為受試生物,通過(guò)分布動(dòng)力學(xué)定量地確定魚(yú)體各組織器官中 TBBPA含量,研究TBBPA在魚(yú)體肝臟、腎臟、鰓和肌肉中的吸收與富集效應(yīng),結(jié)合不同暴露時(shí)間鯽魚(yú)肝臟、腎臟、鰓、性腺的組織病理學(xué),以期初步確定TBBPA在鯽魚(yú)體內(nèi)的分布特征及作用靶器官,為闡明TBBPA的毒性效應(yīng)機(jī)制機(jī)理及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供參考.

1 材料與方法

1.1 組織分布與生物富集實(shí)驗(yàn)方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 鯽魚(yú)(Carassius auratus)購(gòu)于北京市通州區(qū)花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng),體長(zhǎng)為(6.95±1.05)cm,體重為(5.90±0.80)g,在室內(nèi)馴化 2 周,死亡率穩(wěn)定在 1%～2%以下,試驗(yàn)用水為自來(lái)水,室內(nèi)靜置 48h 去氯,溫度(25±1)℃,光周期為 14h:10h,溶液 氧 為 (7.5±0.5)mg/L,pH 值 (7.8±0.2),水 硬 度(109±10)mg/L (以 CaCO3計(jì)).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法 TBBPA工業(yè)品(97%)為美國(guó)Alfa Aesar公司進(jìn)口,采用乙醇作為助溶劑配制50mg/mL的儲(chǔ)備液備用.將360條鯽魚(yú)隨機(jī)放入盛有60L處理液的玻璃缸內(nèi),每缸30條魚(yú),根據(jù)TBBPA對(duì)鯽魚(yú)的 96h-LC50值[10]及慢性毒性實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置的一般規(guī)則[11-12],設(shè)定亞致死處理濃度為 0.5mg/L和2.0mg/L,24h更換一次相同濃度的處理液,并以助溶劑乙醇處理的魚(yú)作對(duì)照,實(shí)驗(yàn)期間每天喂食1次.實(shí)驗(yàn)周期為32d[13].在暴露時(shí)間分別為2,4,8,16,32d取樣,進(jìn)行前處理后(方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[9]),HPLC測(cè)定肝臟、腎臟、鰓和肌肉中TBBPA含量,并利用公式計(jì)算生物富集系數(shù)(公式見(jiàn)2.2節(jié)).

1.2 組織病理切片實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Thermo Shandon Excelsior組織處理機(jī),TKY-BMB,湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司石蠟包埋機(jī),Leica RM2235型切片機(jī),Thermo Shandon Varistain Gemini 全自動(dòng)染片機(jī),Thermo Shandon Consul 全自動(dòng)封片機(jī),德高 Zeiss Imager. M1顯微鏡.

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 暴露實(shí)驗(yàn)第2,4,8,16,32d每次隨機(jī)取10尾鯽魚(yú).取鯽魚(yú)肝臟、腎臟、鰓、精巢和卵巢組織放置于4%甲醛溶液中固定24h,固定后的組織在清水沖洗15h以上,經(jīng)50%～100%各級(jí)乙醇梯度脫水,2:1、1:1、1:2的二甲苯/石蠟和全石蠟逐級(jí)滲透,最后包埋于切片用石蠟中,制成組織蠟塊.將埋有組織的蠟塊固定在切片機(jī)上,7μm 切片,用明膠甘油將組織薄片貼于載玻片上,37℃烘干.組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟和70%～ 100%各級(jí)乙醇梯度脫水,用蘇木精染色,經(jīng)過(guò)1%鹽酸分化和0.1%氨水顯色后,再經(jīng)50%～90%各級(jí)乙醇梯度脫水,用0.5%酒精伊紅(95%酒精配制)染色,95%和 100%的乙醇進(jìn)一步脫水,最后用中性樹(shù)膠封片.顯微鏡下觀測(cè)并拍照,采用Photoshop軟件進(jìn)行圖像處理和分析.觀察各染毒組中甲狀腺濾泡上皮厚度、細(xì)胞肥大和增生、膠質(zhì)減少和濾泡上皮細(xì)胞周?chē)茉錾炔∽儸F(xiàn)象.

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用origin 7.5和sigma Plot 10.0處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 TBBPA在鯽魚(yú)不同器官的組織分布

由圖1可見(jiàn),鯽魚(yú)肝臟組織在第8d出現(xiàn)吸收高峰,隨后下降,其中0.5mg/L暴露組32d TBBPA的濃度低于第2d的濃度,而2.0mg/L暴露組32d后的肝組織濃度為第 2d濃度的 4.1倍,達(dá)到146.61ng/g.0.5mg/L組腎臟組織在4d達(dá)到最大值,隨后逐步降低,32d時(shí)濃度稍高于第 2d,為對(duì)照的4.5倍.2.0mg/L組在第8d達(dá)到最大值,32d時(shí)濃度為第2d濃度的3.4倍,為對(duì)照組的7.3倍.0.5mg/L組的肌肉組織中TBBPA含量隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)緩慢升高,高濃度組在第8d出現(xiàn)吸收高峰,后快速下降,在暴露終點(diǎn)又顯著回升,為對(duì)照組的4倍.低濃度組鰓中TBBPA隨時(shí)間變化幅度較小,第32d與對(duì)照組極為接近,高濃度組第 4d時(shí)出現(xiàn)吸收高峰,32d時(shí)為對(duì)照組的5.2倍.

結(jié)果顯示,各濃度組肝臟和腎臟 TBBPA含量都表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì),鰓和肌肉在0.5mg/L時(shí)TBBPA含量變化不大,高濃度時(shí)先升高后下降,肌肉在暴露后期又出現(xiàn)升高趨勢(shì).

2.2 TBBPA在鯽魚(yú)不同組織器官的生物富集

根據(jù)時(shí)間(x)和TBBPA在鯽魚(yú)不同組織器官的濃度(y)擬合得到式(1),符合毒代動(dòng)力學(xué)一級(jí)吸收模型,根據(jù)所得方程得到各個(gè)參數(shù)見(jiàn)表1,TBBPA暴露實(shí)驗(yàn)中各器官組織富集系數(shù)(a)隨暴露時(shí)間的變化見(jiàn)圖2.

式中:y為T(mén)BBPA在鯽魚(yú)不同組織器官的濃度;x為暴露時(shí)間;擬合公式后得到參數(shù)a,b,x0,其中,a為各器官組織富集系數(shù);x0為相應(yīng)變化時(shí)間.

結(jié)果顯示,各器官富集系數(shù)隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)先升高再逐漸減小.在實(shí)驗(yàn)濃度下肝臟富集系數(shù)相近,最大富集系數(shù)為 395,均落在 10～11d之間;0.5mg/LTBBPA組鯽魚(yú)腎臟的最大富集系數(shù)為 945,2.0mg/L組腎臟的富集系數(shù)遠(yuǎn)小于0.5mg/L處理組,表明鯽魚(yú)腎臟功能可能受損不能執(zhí)行正常的排泄和解毒機(jī)能.2.0mg/L組鯽魚(yú)鰓的富集系數(shù)顯著高于 0.5mg/L組,最大富集系數(shù)為72,時(shí)間為10.26d,肌肉富集系數(shù)變化不大.

圖1 TBBPA在鯽魚(yú)不同器官的組織分布Fig.1 Tissue distribution of TBBPA in Carassius auratus

表1 鯽魚(yú)各器官的富集系數(shù)及參數(shù)Table 1 Bioaccumulation factor and the parameters in

2.3 TBBPA暴露對(duì)鯽魚(yú)器官組織的組織病理變化

對(duì)照組肝組織切片(圖3A)的肝細(xì)胞呈多角型,細(xì)胞核大而圓,核仁居中,胞質(zhì)染色深,細(xì)胞膜界限清晰.暴露后2d,肝細(xì)胞輕微腫脹,胞質(zhì)淡染,部分細(xì)胞空泡化,單位面積內(nèi)肝細(xì)胞數(shù)量減少.暴露后 4～8d,肝細(xì)胞腫脹嚴(yán)重,肝細(xì)胞索狀結(jié)構(gòu)破壞,肝細(xì)胞彌散.暴露后 16d,肝細(xì)胞索狀結(jié)構(gòu)消失,部分細(xì)胞的胞膜破裂、溶解,胞漿基質(zhì)變淡,胞核高度濃縮,有的甚至核仁都不可見(jiàn),發(fā)現(xiàn)色素沉積物.暴露后32d(圖3B),肝細(xì)胞腫脹擴(kuò)展到整個(gè)肝,細(xì)胞基質(zhì)大量丟失,胞核固縮(壞死),高濃度組中發(fā)現(xiàn)大量色素沉積物,經(jīng)普魯士藍(lán)染色證實(shí)為含鐵血黃素沉積物.實(shí)驗(yàn)中暴露TBBPA后,鯽魚(yú)肝臟表現(xiàn)出時(shí)間-劑量依賴(lài)性的病理?yè)p傷,具體分析見(jiàn)表 2,說(shuō)明肝臟可能是TBBPA作用的靶器官.

對(duì)照組腎組織切片(圖 3C)的正常腎小體為一圓囊結(jié)構(gòu),腎小球是一團(tuán)毛細(xì)血管,腎小囊包在腎小球外面,兩層之間為腎小囊腔.暴露后 2～4d,腎小管中有彌散的色素沉積,部分腎小球毛細(xì)血管明顯萎縮,甚至壞死,并在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)少量色素沉積物.暴露后 8～16d,腎小球毛細(xì)血管明顯萎縮,腎小囊腔變寬,腎小球及其附近區(qū)域發(fā)現(xiàn)大片的色素沉積物,腎小管上皮細(xì)胞中色素沉積增多.暴露后32d(圖3D),腎小球囊內(nèi)大片的色素沉積,可能為壞死的腎小球毛細(xì)血管球殘骸,經(jīng)普魯士藍(lán)染色證明是含鐵血黃素.暴露TBBPA后腎臟的病變呈時(shí)間依賴(lài)性增長(zhǎng),具體分析見(jiàn)表3,主要表現(xiàn)為腎小球毛細(xì)血管萎縮、壞死,腎小囊腔變寬,腎小球及腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)色素沉積增多,但兩劑量組之間差異不顯著.

圖2 長(zhǎng)期暴露后TBBPA在鯽魚(yú)不同器官組織的生物富集系數(shù)(BCF)變化Fig.2 Bioconcentration factor (BCF) of TBBPA in different tissues of Carassius auratus after longterm exposure

對(duì)照組鰓絲切片(圖 3E)結(jié)構(gòu)完整清晰,鰓小片排列整齊有序.暴露后 2～4d,鰓切片中觀察到鰓小片上皮細(xì)胞輕度增生,部分還伴有鰓小片細(xì)胞的脫落,使鄰近鰓小片相互粘連.暴露后 8～6d,鰓小片上皮細(xì)胞增生加劇,部分鰓小片扭曲、細(xì)胞脫落.暴露后 32d(圖 3F),在兩劑量組均可觀察到鰓小片大量融合.

表2 鯽魚(yú)肝組織結(jié)構(gòu)隨暴露時(shí)間變化Table 2 Liver structure changes of Carassius auratus with time in chronic exposure test

表3 鯽魚(yú)腎組織結(jié)構(gòu)隨暴露時(shí)間變化Table 3 Kidney structure changes of Carassius auratus with time in chronic exposure test

圖3 鯽魚(yú)TBBPA暴露的器官組織病理觀察Fig.3 Observation of histopathology exposured TBBPA in Carassius auratus

對(duì)照組精巢切片(圖 3G)可見(jiàn)排列整齊完整的精小葉,精小葉腔內(nèi)充滿大量的精子細(xì)胞,核圓形,較致密,聚集在一起形成大的團(tuán)塊.暴露后 2～4d,精小葉排列混亂,基膜局部溶解,間質(zhì)細(xì)胞增多.暴露后8～16d,精小葉基膜部分溶解,小葉間質(zhì)進(jìn)一步擴(kuò)大.暴露后 32d(圖 3H),精小葉基膜相互溶解,精子聚集在一起形成大的團(tuán)塊,基膜外間質(zhì)細(xì)胞局部增多.

對(duì)照組和兩劑量組卵巢切片觀察(圖3I,J),卵母細(xì)胞呈圓形、橢圓形或多角形,細(xì)胞質(zhì)嗜堿性,核淺藍(lán)色,位于細(xì)胞中央.核仁沿核膜內(nèi)緣分布.經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn),對(duì)照組與處理組未見(jiàn)異?，F(xiàn)象.

3 討論

肝臟是生物體最主要的物質(zhì)代謝場(chǎng)所和解毒器官,污染物易造成肝臟的脂肪化和細(xì)胞擴(kuò)增等組織損傷[14],還可造成線粒體囊泡化和細(xì)胞核損傷等超微結(jié)構(gòu)的變化[15].組織學(xué)研究表明,TBBPA能引起孕期小鼠的肝臟損傷[16].本研究結(jié)果表明,TBBPA暴露對(duì)肝臟表現(xiàn)為時(shí)間-劑量依賴(lài)性關(guān)系,同時(shí)病理切片顯示,鯽魚(yú)肝細(xì)胞空泡變性,細(xì)胞核膜破裂、核仁溶解消失,部分肝細(xì)胞壞死,表明 TBBPA蓄積對(duì)肝臟具有較強(qiáng)毒害作用[17-19].陳瑪麗等[20]發(fā)現(xiàn) TBBPA 低劑量(0.025,0.25mg/L)暴露12周能夠引起紅鯽肝臟脂肪化、空泡化和線粒體囊泡化等現(xiàn)象,而高劑量暴露還導(dǎo)致肝臟細(xì)胞核損傷和細(xì)胞間隙增大等現(xiàn)象,造成紅鯽肝臟的損傷.這可能與污染物通過(guò)引起肝臟的物質(zhì)代謝紊亂[20],或者通過(guò)誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生導(dǎo)致肝臟細(xì)胞代謝增強(qiáng), 進(jìn)而引起肝臟中物質(zhì)代謝紊亂[21-24]有關(guān).

腎臟是魚(yú)體最重要的毒物排泄器官,腎功能受損時(shí),以腎臟作為主要去除途徑的毒物消除速度減慢,可產(chǎn)生蓄積和病變,排泄 TBBPA 機(jī)能受損,導(dǎo)致血液 TBBPA含量升高使血流不豐富的肌肉組織也出現(xiàn) TBBPA的積累現(xiàn)象.Schauer等[25]在研究小鼠一次口服300mg TBBPA/kg bw的代謝動(dòng)力學(xué)時(shí)發(fā)現(xiàn),TBBPA在小鼠體內(nèi)的代謝半衰期為13h,由于TBBPA與谷胱甘肽等生物轉(zhuǎn)化酶或發(fā)生硫化反應(yīng)使其生物利用性降低,TBBPA對(duì)機(jī)體的損害是通過(guò)與受體或酶的結(jié)合進(jìn)行的.而 kang等[26]研究發(fā)現(xiàn)小鼠完全排泄TBBPA需要2d,TBBPA不會(huì)在體內(nèi)積累,對(duì)腎臟沒(méi)有損傷.本研究表明低濃度 TBBPA暴露鯽魚(yú)肝臟和腎臟可正常代謝,高濃度組則代謝受阻.這可能與 TBBPA隨血液進(jìn)入腎臟后,自由基對(duì)細(xì)胞中的各種酶造成損傷,使魚(yú)類(lèi)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)損傷所致[27-28],產(chǎn)生蓄積和病變,排泄機(jī)能受損有關(guān).

本研究中鯽魚(yú)精巢的病理?yè)p傷嚴(yán)重,精小葉基膜破裂,這可能導(dǎo)致小葉內(nèi)部環(huán)境的紊亂,激素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的平衡受到破壞,不利于精子的成熟和發(fā)育,這一結(jié)論與陳瑪麗[29]的研究結(jié)果一致,而本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),在相同 TBBPA濃度暴露下鯽魚(yú)卵巢組織未發(fā)現(xiàn)病理?yè)p傷,表明 TBBPA暴露下鯽魚(yú)精巢比卵巢更易受到毒害威脅.在對(duì)鯽魚(yú)鰓切片的的觀察表明,鰓小片上皮細(xì)胞大面積增生、融合會(huì)嚴(yán)重影響鰓的正常氣體交換,這必然影響鰓的呼吸、分泌和排泄功能,這些與在試驗(yàn)過(guò)程中觀察到的實(shí)驗(yàn)組的魚(yú)經(jīng)常將嘴露出水面或鰓蓋煽動(dòng)速度加快的缺氧現(xiàn)象相吻合.

4 結(jié)論

4.1 組織分布動(dòng)力學(xué)的研究表明,肝臟和腎臟是 TBBPA含量最高的部位,具有較強(qiáng)生物富集能力. 在暴露10～11d時(shí),肝臟和腎臟富集能力最強(qiáng),最大富集系數(shù)分別達(dá)到395和945.鰓和肌肉的富集能力較低.

4.2 不同濃度 TBBPA暴露后,鯽魚(yú)肝臟、腎臟和鰓均表現(xiàn)出時(shí)間-劑量依賴(lài)性的病理?yè)p傷,低濃度肝組織切片未見(jiàn)明顯病變; 腎臟有彌散性沉積;鰓小片上皮細(xì)胞輕度增生,部分伴有鰓小片細(xì)胞的脫落,后期有融合現(xiàn)象.高濃度肝細(xì)胞腫脹嚴(yán)重,肝細(xì)胞索狀結(jié)構(gòu)破壞,肝細(xì)胞彌散,細(xì)胞基質(zhì)大量丟失,胞核固縮;腎小球毛細(xì)血管明顯萎縮,甚至壞死;鰓小片上皮細(xì)胞的大面積增生,致使數(shù)條鰓小片融合在一起.

4.3 在相同暴露濃度下,雄魚(yú)的性腺損傷程度高于雌魚(yú).精巢在2.0mg/L TBBPA暴露下病理?yè)p傷嚴(yán)重,卵巢未發(fā)現(xiàn)明顯病變.

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