劉 薇,袁興中*,曾光明,黃華軍,崔凱龍,彭 馨,方振敏,郭靈芝,趙艷鴿

(1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410082；2.湖南大學(xué),環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410082)

纖維素是一種含量豐富的自然資源,但目前這些資源大部分通過焚燒等簡單的方式利用,不僅浪費(fèi)了資源還對環(huán)境造成了污染[1].通過纖維素酶降解纖維素是一種有效利用纖維素的生物技術(shù),因此,通過反膠束萃取技術(shù)獲得高效木質(zhì)纖維素酶極具現(xiàn)實(shí)意義[2].

反膠束萃取是反膠束溶液與含有酶蛋白的水相接觸后,由于反膠束溶液表面與酶蛋白表面間的相互作用,在兩相界面形成了包含有酶蛋白的反膠束,此反膠束擴(kuò)散進(jìn)入有機(jī)相中,從而實(shí)現(xiàn)了酶蛋白的萃取[3].反膠束萃取技術(shù)具有成本低、溶劑可反復(fù)利用、萃取率高、條件溫和不易引起酶蛋白變性等優(yōu)點(diǎn)[4].尋找更好的新的反膠束體系是反膠束萃取酶等生物大分子技術(shù)的發(fā)展方向之一.目前國內(nèi)外研究的主要是化學(xué)表面活性劑構(gòu)建的反膠束體系,資源有限且合成過程中易造成環(huán)境污染.常用的化學(xué)表面活性劑有雙(2-乙基己基)磺基琥珀酸鈉(AOT)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、氯化三辛基甲銨(TCMAC)、磷脂酰乙醇胺(PTEA)以及磷脂酸(PTA)等.而生物表面活性劑則以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、環(huán)境無毒、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)引起人們的注意[5-10].現(xiàn)階段生物表面活性劑用于反膠束萃取還處于試驗(yàn)性階段,但其具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益.通過對生物表面活性劑反膠束萃取酶蛋白的工藝進(jìn)行改進(jìn),或開發(fā)和應(yīng)用不同的產(chǎn)品,生物表面活性劑將很有可能成為化學(xué)表面活性劑的代替品或升級品.微生物生產(chǎn)的生物表面活性劑的種類很多,如鼠李糖脂(RL)、槐糖脂、海藻糖脂、纖維素二糖脂、表面活性激素等.目前,有關(guān)生物表面活性劑和化學(xué)表面活性劑構(gòu)建的反膠束體系萃取纖維素酶的條件優(yōu)化對比的研究甚少.

因此,本研究以有效萃取分離纖維素酶為目的,從水相pH值、離子強(qiáng)度、離子種類、表面活性劑的種類及濃度等方面對比分析了 3種表面活性劑(陰離子型AOT和RL、陽離子型CTAB)構(gòu)建的反膠束體系的萃取條件及機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

表面活性劑:化學(xué)表面活性劑 CTAB(天津市科密歐化學(xué)試劑廠)、AOT(Sigma);生物表面活性劑鼠李糖脂(實(shí)驗(yàn)室自制).

油相:溶劑異辛烷(天津市大茂化學(xué)試劑廠),助溶劑正己醇(天津市福晨化學(xué)試劑廠).

水相:超純水;其他試劑:纖維素酶(上海貝塔生物制品有限公司).

主要儀器:紫外分光光度計(jì),磁力攪拌器,電熱恒溫水浴鍋,離心機(jī),超聲波振蕩器,pH計(jì)等.

1.2 反膠束體系的構(gòu)建及其對纖維素酶的萃取

取一定量的表面活性劑溶解于5mL異辛烷/正己醇混合液(異辛烷/正己醇=4.5mL:0.5mL),再將0.5mg/mL粗纖維素酶水溶液和上述混合液等體積混合置于錐形瓶中,磁力攪拌 30min,達(dá)萃取平衡后,4000r/min離心 20min分相,上清液即為反膠束的前萃液,下層為萃余液[11-12].反膠束萃取示意圖如圖1所示.

圖1 反膠束萃取纖維素酶的示意Fig.1 Schematic representation of the reversed micellar extraction of cellulase

用考馬斯亮藍(lán)法[13]測定原酶液和萃余相中酶蛋白含量.萃取率(E)=(初始水相中纖維素酶蛋白含量-萃余液中纖維素酶蛋白含量)/(初始水相中纖維素酶蛋白含量).

2 結(jié)果與討論

2.1 水相pH值對不同反膠束體系萃取的影響

在室溫條件下,AOT、CTAB和RL 3種表面活性劑的濃度分別為 23.7,15,2.75mmol/L,NaCl濃度為 0.05mol/L,研究水相 pH值(pH=3.0～8.0)對不同反膠束體系萃取纖維素酶的影響,結(jié)果如圖2所示.

由圖 2可知,由陰離子表面活性劑 AOT和RL構(gòu)建的反膠束體系的萃取率隨著水相pH值的降低而升高,且均在pH值為3.0時(shí)達(dá)到最高萃取率(AOT為66.73%和RL為47.14%).而陽離子表面活性劑 CTAB構(gòu)建的反膠束體系的萃取率隨著水相pH值的升高而升高,在pH值為8.0時(shí)達(dá)到最高萃取率84.57%.比較各反膠束體系在實(shí)驗(yàn)條件下的最佳萃取率:CTAB>AOT>RL.pH值較低(pH2)或較高(pH9)時(shí),兩相界面間出現(xiàn)白色膜狀物沉淀,萃取率急劇下降且蛋白質(zhì)部分變性.

水相 pH值對萃取率的影響主要表現(xiàn)在對蛋白質(zhì)的表面電荷及蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變,pH值決定了酶蛋白帶電基團(tuán)的解離速率和所帶的凈電荷.對于陰離子表面活性劑AOT和RL形成的反膠束,萃取一般只發(fā)生在pHpI時(shí),此時(shí),酶蛋白帶負(fù)電,與帶正電的表面活性劑極性頭之間相互吸引.水相 pH值與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI之間的差值|pH-pI|是蛋白質(zhì)與表面活性劑靜電引力的量度,|pH-pI|越大,萃取率越大[14].因此,AOT與 RL形成的反膠束的最高萃取率在 pH=3.0時(shí)獲得,CTAB的最高萃取率在pH=8.0時(shí)獲得.此外,陰離子表面活性劑在水相pH>pI時(shí),陽離子表面活性劑在pH

圖2 在不同反膠束中pH值對纖維素酶萃取率的影響Fig.2 Effect of aqueous phase pH on the exaction of cellulase in different reverse micelles

2.2 表面活性劑濃度對不同反膠束體系萃取的影響

在室溫條件下,調(diào)節(jié)各反膠束體系中水相pH值為最佳值:AOT、CTAB和 RL反膠束體系中水相 pH分別為 pH=3.0、pH=8.0和 pH=3.0,水相中NaCl濃度為0.05mol/L,分別改變各反膠束中表面活性劑的濃度(表1).表面活性劑AOT、CTAB和 RL的臨界膠束濃度(CMC)分別為:0.79mmol/L、1.00mmol/L,0.055mmol/L.研究各反膠束中表面活性劑濃度對纖維素酶萃取的影響,結(jié)果如圖3所示.

表1 不同反膠束中表面活性劑的濃度(mmol/L)Table1 Surfactant concentration in different reverse micelles(mmol/L)

圖3 在不同反膠束體系中表面活性劑濃度對纖維素酶萃取率的影響Fig.3 Effect of surfactant on the exaction of cellulase in different reverse micelles

由圖 3可知,各表面活性劑都存在一個(gè)最佳濃度,AOT的最佳濃度為 30倍 CMC (=23.7mmol/L), CTAB的最佳濃度為15倍CMC (=15mmol/L),RL的最佳濃度為 50倍 CMC(=2.75mmol/L),在此濃度下,纖維素酶的萃取效果最好.各表面活性劑濃度太高或太低,都不利于各反膠束萃取纖維素酶.比較各反膠束體系在實(shí)驗(yàn)條件下的最佳萃取率:CTAB>AOT>RL.

表面活性劑濃度對纖維素酶萃取性能的影響主要表現(xiàn)在改變反膠束數(shù)量與反膠束相的聚集結(jié)構(gòu)兩方面.

表面活性劑濃度較低時(shí),增加表面活性劑的濃度使反膠束聚集數(shù)和反膠束相的整體極性增加,從而引起偶極子-偶極子間的作用減弱,此時(shí),酶蛋白增溶到反膠束的機(jī)會增多.但是,表面活性劑的濃度不能過高,否則萃取率會降低.這是由于表面活性劑的濃度增大,水含量不變的情況下,W0(有機(jī)相中水與表面活性劑的物質(zhì)的量比,稱為含水率)值變小,則反膠束的尺寸也隨之減小,當(dāng)反膠束減小到小于被萃取的酶蛋白分子的體積時(shí),酶蛋白分子受空間阻力的作用不能進(jìn)入反膠束[16].所以,當(dāng)表面活性劑濃度較低時(shí),增加表面活性劑濃度,蛋白質(zhì)萃取率增大;當(dāng)表面活性劑增加到一定濃度時(shí),酶蛋白萃取率達(dá)到最大;隨后,隨著表面活性劑濃度的增加,酶蛋白的萃取率開始下降.

2.3 離子強(qiáng)度對不同反膠束體系萃取的影響

在室溫條件下,在表面活性劑 AOT、CTAB和RL最佳濃度分別為23.7,15,2.75mmol/L,調(diào)節(jié)AOT、CTAB和RL反膠束體系中水相pH值分別為3、8和3,調(diào)節(jié)粗纖維素酶液中NaCl的濃度為 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mol/L,研究各反膠束體系中鹽離子濃度對纖維素酶萃取的影響,結(jié)果如圖4所示.

由圖 4可知,在離子強(qiáng)度為 0.05mol/L時(shí),3種表面活性劑構(gòu)成的反膠束體系萃取纖維素酶的效率均達(dá)到最大值.隨著離子強(qiáng)度的增大,反膠束的萃取率均下降.且在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),離子強(qiáng)度太小時(shí)(小于0.05mol/L時(shí)),容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象(圖 5),難以分相.比較各反膠束體系在實(shí)驗(yàn)條件下的最佳萃取率:CTAB>AOT>RL.

少量的鹽起鹽溶作用,能夠增加蛋白質(zhì)的溶解度,從而提高酶蛋白的萃取率.但鹽濃度太低,反膠束乳化現(xiàn)象嚴(yán)重,水相和有機(jī)相難以分相.隨著鹽濃度的增加,一方面,離子強(qiáng)度越大,反膠束內(nèi)表面雙電池變薄,酶蛋白與反膠束內(nèi)表面之間的相互吸引力減弱,酶蛋白的溶解降低;第二個(gè)方面,反膠束內(nèi)表面雙電層變薄,表面活性劑極性頭之間的相互作用也隨之減弱,反膠團(tuán)體積減小,酶蛋白不易進(jìn)入;第三個(gè)方面,離子強(qiáng)度增大時(shí),離子向反膠束體系中水池的遷移也增大了,影響酶蛋白的溶解,甚至引起酶蛋白從反膠束中鹽析出來[17-18].當(dāng)鹽濃度為 0.05mol/L時(shí),3種反膠束體系對纖維素酶的萃取率均達(dá)到最大.隨著鹽濃度的升高,萃取率均下降.

圖4 在不同反膠束體系中鹽濃度對纖維素酶萃取率的影響Fig.4 Effect of salt concentration on the exaction of cellulase in different reverse micelles

圖5 離子強(qiáng)度過低時(shí)產(chǎn)生的乳化現(xiàn)象Fig.5 Emulsification phenomenon at low ionic strength

2.4 鹽離子種類對不同反膠束體系萃取的影響

室溫條件下,在 AOT、CTAB和RL的濃度分別為最佳濃度, 調(diào)節(jié)AOT、CTAB和RL反膠束體系中水相pH值分別為3、8和3,調(diào)節(jié)粗纖維素酶液中鹽離子的濃度為 0.05mol/L,改變離子種類為 NaCl、NaBr、KCl、KBr,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示.

對于陰離子表面活性劑,改變水相中陰離子種類(Cl-、Br-),對萃取率無明顯影響,而改變陽離子種類(Na+、K+),對萃取率有強(qiáng)烈的影響,且在相同的離子強(qiáng)度下,影響程度 K+>Na+.對于陽離子表面活性劑則相反,改變陽離子種類(Na+、K+),對萃取率無明顯影響,而改變陰離子種類(Cl-、Br-),對萃取率有強(qiáng)烈的影響,且在相同的離子強(qiáng)度下,影響程度 Br->Cl-.比較各反膠束體系在本實(shí)驗(yàn)條件下的最佳萃取率:CTAB>AOT>RL.

表2 在不同反膠束體系中鹽離子種類對纖維素酶萃取率(%)的影響Table.2 Effect of salt species on the exaction of cellulase in different reverse micelles(%)

離子種類會影響表面活性劑極性頭的靜電屏蔽作用,從而阻礙酶蛋白與表面活性劑間的相互作用.離子半徑大的靜電屏蔽作用大,萃取率就小[19].所以,對于陰離子表面活性劑,K+比 Na+的影響程度大,產(chǎn)生的靜電屏蔽作用強(qiáng),萃取率較小,而陰離子種類對萃取率影響不大;對于陽離子表面活性劑,Br-比 Cl-的影響程度大,產(chǎn)生的靜電屏蔽作用強(qiáng),萃取率較小,而陽離子種類對萃取率影響不大[20].

2.5 表面活性劑種類對纖維素酶萃取效率的影響

表面活性劑的種類會影響反膠束的大小和形狀,從而影響酶蛋白的萃取:不同的表面活性劑形成的反膠束W0值(膠束的含水率,W0=[H2O]/[表面活性劑])不同.W0值較小時(shí),反膠束的尺寸比較小,大分子酶蛋白受到空間阻力不能增溶到反膠束內(nèi)腔;當(dāng)W0值較大時(shí),則不存在空間阻礙作用,酶蛋白易進(jìn)入反膠束內(nèi)腔,萃取率較高.Goto 等[21]發(fā)現(xiàn)表面活性劑的結(jié)構(gòu),特別是它的疏水部位強(qiáng)烈影響酶蛋白的萃取.當(dāng)酶蛋白從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相時(shí),在界面處與表面活性劑形成中間復(fù)合物,即界面復(fù)合物,它的疏水性(由表面活性劑結(jié)構(gòu)決定)對萃取率起到關(guān)鍵性影響.當(dāng)界面復(fù)合物有較強(qiáng)的疏水性時(shí),酶蛋白易溶于有機(jī)相,萃取率高;當(dāng)界面復(fù)合物有較弱疏水性時(shí),酶蛋白難溶于有機(jī)相,沉淀于水相,或聚集在界面處,大大降低了萃取率[22-23].表面活性劑結(jié)構(gòu)的微小不同,將會產(chǎn)生完全不同的萃取效果,反膠束萃取纖維素酶時(shí),應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣?

綜合考慮不同表面活性劑種類對反膠束大小和形狀及界面復(fù)合物疏水性的影響,比較了各反膠束體系在優(yōu)化條件下的最佳萃取率為CTAB>AOT>RL.

3 結(jié)論

3.1 各表面活性劑構(gòu)成的反膠束體系萃取纖維素酶的最佳條件為:陰離子表面活性劑 AOT和RL構(gòu)建的反膠束體系水相最佳pH值為3.0,陽離子表面活性劑 CTAB為 8.0;AOT、CTAB、RL的最佳濃度分別為 23.7,15,2.75mmol/L;鹽離子濃度均為 0.05mol/L;對于陰離子表面活性劑構(gòu)成的反膠束,改變水相中陰離子種類對萃取率無明顯影響,陽離子種類對萃取率影響程度K+>Na+,而對于陽離子表面活性劑構(gòu)成的反膠束,改變水相中陽離子種類對萃取率無明顯影響,陰離子種類對萃取率影響程度Br->Cl-.

3.2 生物表面活性劑和化學(xué)表面活性劑都能實(shí)現(xiàn)對纖維素酶的有效萃取.不同表面活性劑構(gòu)建的反膠束萃取纖維素酶的最佳萃取率為CTAB>AOT>RL.

[1]Zeng X Y, Ma Y T, Ma L R. Utilization of straw in biomass energy in China [J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews,2007,11(5):976-987.

[2]Zhang Y H, Himmel M E, Mielenz J R. Outlook for cellulaseimprovement: Screening and selection strategies [J].Biotechnology Advances, 2006,24(5):452-481.

[3]G?klen K E, Hatton T A. Protein extraction using reverse micelles[J]. Biotechnology Progress, 1985,1(1):69-74.

[4]Leser M E, Luisi P L. Application of reverse micelles for the extraction of amino acids and proteins [J]. Swiss Chemical Society, 1990,44(9):270-280.

[5]陳桂秋,曾光明,黃國和,等.鼠李糖脂的表面化學(xué)和生物合成及其在垃圾堆肥中的應(yīng)用展望 [J]. 中國生物工程雜志, 2005,(B04):125-130.

[6]Mulligan C N. Environmental applications for biosurfactants [J].Environmental Pollution, 2005,133(2):183-198.

[7]Mukherjee S, Das P, Sen R. Towards commercial production of microbial surfactants [J]. Trends in Biotechnology, 2006, 24(11):509-515.

[8]崔凱龍,袁興中,曾光明,等.生物表面活性劑用于逆膠束體系的構(gòu)建及微水相條件優(yōu)化 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2011,31(9):1444-1450.

[9]Peng X, Yuan X Z, Zeng G M, et al. Extraction and purification of laccase by employing anovel rhamnolipid reversed micellar system [J]. Process biochemistry, 2012,47(5):742-748.

[10]郭靈芝,袁興中,曾光明,等.木素過氧化物酶的逆膠束純化研究[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2012,32(6):1104-1109 .

[11]Hebbar H U, Sumana B, Raghavarao K S M S. Use of reverse micellar systems for the extraction and puri fi cation of bromelain from pineapple wastes [J]. Bioresource Technology, 2008,99(11):4896-4902.

[12]許林妹,許虎君,盧青松,等.Gemini型陽離子表面活性劑反膠束體系萃取纖維素酶的研究 [J]. 食品科學(xué), 2006,27(02):72-75.

[13]安志強(qiáng),孫新順,喬文慶.考馬斯亮藍(lán)法測定青霉素發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)含量 [J]. 河北化工, 2010,33(9):60-61.

[14]Kilikian B V, Bastazin M R, Minami N M, et al. Liquid-liquid extraction by reversed micelles in biotechnological processes [J].Brazilian Journal of Chemical Engineering, 2000,17(1):29–38.

[15]Gaikaiwari R P, Wagh S A, Kulkarni B D. Efficient lipase purification using reverse micellar extraction [J]. Bioresource Technology, 2012,108:224-230.

[16]Nandini K E, Rastogi N K. Reverse micellar extraction for downstream processing of lipase:Effect of various parameters on extraction [J]. Process Biochemistry, 2009,44(10):1172–1178.

[17]Sun X H, Zhu K X, Zhou H M. Protein extraction from defatted wheat germ by reverse micelles:Optimization of the forward extraction [J]. Journal of Cereal Science, 2008,48(3):829–835.

[18]Andrews B A, Pyle D L, Asenjo J A. The effects of pH and ionic strength on the partitioning of four proteins in reverse micelle systems [J]. Biotechnology and Bioengineering, 1994(43):1052-1058.

[19]Kinugasa T, Kondo A, Mouri E, et al. Effects of ion species in aqueous phase on protein extraction into reversed micellar solution [J]. Separation and Purification Technology, 2003,31(3):251-259.

[20]王金枝,曹學(xué)君.反膠束萃取技術(shù)分離胰激肽原酶 [J]. 中國生物工程雜志, 2007,27(3):93-99.

[21]Goto M, Ono T, Nakashio F, et al. Design of new surfactants suitable for protein extraction by reversed micelles [J].Biotechnology and Bioengineering, 1997,54:26-32.

[22]Zhao X Y, Wei Z Y, Du F L, et al. Effects of surfactant and salt species in reverse micellar forward extraction efficiency of isoflavones with enriched protein from soy flour [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010,162(7):2087–2097.

[23]婁文勇,宗敏華,劉森林,等.反膠束萃取酶蛋白的研究進(jìn)展 [J].工業(yè)微生物, 2001,31(4):54-58.