陳賀佳，牟光慶

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034）

混合乳酸菌復(fù)合凍干保護(hù)劑的研究

陳賀佳，牟光慶*

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034）

摘 要：將嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌按3∶2∶1比例制備乳酸菌凍干保護(hù)劑。通過正交試驗(yàn)確定混合乳酸菌最佳保護(hù)劑配方為：甘氨酸1.0%，脫脂乳10.0%，海藻糖7.0%，山梨醇1.0%。研究表明，凍干乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵酸度、產(chǎn)香及產(chǎn)黏特性良好，且冷凍干燥法制備的復(fù)合凍干保護(hù)劑對菌種保護(hù)效果優(yōu)于單一保護(hù)劑。

關(guān)鍵詞：冷凍干燥；乳酸菌；保護(hù)劑

目前真空冷凍干燥技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各類發(fā)酵劑的制備和商業(yè)化生產(chǎn)中。與傳統(tǒng)的液體發(fā)酵劑、低溫干燥和噴霧干燥方法相比，冷凍干燥后的乳酸菌發(fā)酵劑具有保存期長、菌種不易退化、運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)[1]。通過真空冷凍干燥原理分析，其干燥過程會(huì)造成乳酸菌的損傷[2]。研究表明，添加保護(hù)劑可以改變冷凍干燥時(shí)菌體細(xì)胞所處的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥對菌體細(xì)胞的損害，使乳酸菌保持原有的理化特性和生物活性，因此保護(hù)劑有效利用已成為提高菌種存活率的關(guān)鍵技術(shù)[3]。本研究將嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌按3∶2∶1比例[4]混合，進(jìn)行乳酸菌凍干保護(hù)劑的研究，以選擇最佳混合保護(hù)劑配方，達(dá)到凍干后菌種存活率最高的目的。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophils，S.t）來自西藏雪蓮，高產(chǎn)胞外多糖，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳酸菌菌庫提供；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，L.a），為大連工業(yè)大學(xué)保藏菌種；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，L.b），篩選自輝山酸奶。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種傳代和活化用12%脫脂乳培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)用MRS培養(yǎng)基[5]。

1.1.3 凍干保護(hù)劑

賴氨酸、甘氨酸、谷氨酸、VC、甘露醇、甘油、山梨醇、乳糖、蔗糖、果糖、海藻糖、麥芽糖、可溶性淀粉均為分析純或生化試劑，脫脂乳粉：完達(dá)山乳業(yè)有限公司。

以上凍干保護(hù)劑分別配制成高濃度溶液。其中氨基酸、糖類和VC溶液經(jīng)0.22 μm孔徑微濾膜過濾除菌，其它凍干保護(hù)劑115℃滅菌15 min[6-7]。滅菌后于4℃冰箱備用。

1.1.4 儀器設(shè)備

4K系列真空冷凍干燥機(jī)：VirTis公司；Stratos冷凍離心機(jī)：Thermo Scientific公司；PHS-3C型精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；NB-1系列數(shù)字式黏度計(jì)：上海泥潤智能有限公司；手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫(yī)療儀器有限公司；722型光柵分光光度計(jì)：山東高密彩虹分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 凍干保護(hù)劑選擇實(shí)驗(yàn)流程

菌種活化→擴(kuò)大培養(yǎng)→離心→收集菌體→測活菌數(shù)→加入保護(hù)劑→分裝→預(yù)凍→真空冷凍干燥→復(fù)水→測活菌數(shù)

1.2.2 菌種收集

取脫脂乳活化后的菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，接種量3%，42℃培養(yǎng)24 h。將擴(kuò)大培養(yǎng)液加入無菌離心管中，4℃，6 000 r/min離心10 min收集菌體，去除上清液[8-10]。

1.2.3 乳酸菌冷凍干燥工藝條件

菌懸液分裝厚度為4 mm，預(yù)凍溫度為－80℃，預(yù)凍時(shí)間為12 h，凍干時(shí)間為8 h。

1.2.4 冷凍干燥存活率的確定

凍干前活菌數(shù)檢測：將待測樣品梯度稀釋，采用傾注平板計(jì)數(shù)法檢測活菌數(shù)[5]。

凍干后活菌數(shù)檢測：向凍干菌粉中加入0.9%無菌生理鹽水，補(bǔ)足至原體積，活菌數(shù)檢測方法同上。

測凍干前后的活菌數(shù)，按照下列公式計(jì)算存活率：

存活率=凍干后用0.9%生理鹽水補(bǔ)足至凍干前體積的活菌數(shù)/凍干前活菌數(shù)×100%1.2.5 酸度的測定

總酸度（T°）：測定24 h內(nèi)總酸度的變化情況，每隔2小時(shí)測一次，用0.1 mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行酸堿滴定[11]。

pH：用酸度計(jì)測定發(fā)酵24 h內(nèi)pH變化情況，每隔2 h測一次。

1.2.6 粘度的測定

用粘度計(jì)測定發(fā)酵24 h內(nèi)黏度的變化情況，每隔4 h測定一次。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌凍干保護(hù)劑篩選

根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果[12-14]選取15種不同濃度保護(hù)劑分別添加至離心菌泥中，制成菌懸液。凍干前其菌懸液的活菌數(shù)為2.16×1010CFU/mL，凍干后計(jì)算其存活率，不同種凍干保護(hù)劑對乳酸菌存活率影響的平均值存在顯著性差異（P<0.05）。運(yùn)用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，結(jié)果如表1。

表1 乳酸菌凍干保護(hù)劑存活率多重比較結(jié)果分析表Table 1 Multiple comparisons of the cryoprotectants survival rate on lactobacillus

由表1所得結(jié)果，可以看出不同凍干保護(hù)劑對乳酸菌的保護(hù)效果均顯著的高于無菌水的對照組。未添加保護(hù)劑的對照組（無菌水）乳酸菌凍干存活率僅為1.6%，添加凍干保護(hù)劑的乳酸菌存活率均在20%以上，說明本試驗(yàn)所選用的15種不同濃度的保護(hù)劑對乳酸菌均起到了保護(hù)效果，從而提高了凍干存活率。氨基酸、醇類、雙糖、大分子物質(zhì)保護(hù)效果最好的分別為：甘氨酸38.1%、山梨醇39.5%、海藻糖48.4%、脫脂乳50.5%。

2.2 乳酸菌凍干保護(hù)劑優(yōu)化

研究表明，保護(hù)劑主要分為蛋白質(zhì)、多糖、小分子糖、醇和維生素，采用添加保護(hù)劑的方法可以減輕冷凍和干燥過程所造成的細(xì)胞損傷、死亡及某些酶蛋白分子的鈍化[15-16]。通過對保護(hù)劑的篩選試驗(yàn)以存活率作為衡量指標(biāo)，選擇存活率較高的甘氨酸、脫脂乳、海藻糖和山梨醇四種保護(hù)劑為因素，以凍干存活率為指標(biāo)，建立L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

比較表1和表2可知，添加單一保護(hù)劑的乳酸菌凍干存活率在20.2%～50.4%，而添加正交試驗(yàn)中9種復(fù)合保護(hù)劑的乳酸菌凍干存活率在57.2%～89.4%，說明復(fù)合保護(hù)劑對乳酸菌保護(hù)效果比單一保護(hù)劑保護(hù)效果好。由表2極差分析可知，因素對試驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序是B＞A＞C＞D，即脫脂乳對復(fù)合乳酸菌的凍干保護(hù)效果最好，其次是甘氨酸、海藻糖，山梨醇的保護(hù)作用最差。試驗(yàn)確定最佳組合為A2B2C3D1，即甘氨酸1.0%，脫脂乳10.0%，海藻糖7.0%，山梨醇1.0%，在此條件下，凍干存活率達(dá)到89.1%。

表2 凍干保護(hù)劑優(yōu)化L9（34）正交設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2Plans and results of L9（34）on cryoprotectants

2.3 產(chǎn)酸能力

產(chǎn)酸能力強(qiáng)弱是酸奶生產(chǎn)選用菌種和判斷菌種發(fā)酵活力的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)以總酸度和pH為衡量指標(biāo)，來檢測凍干后菌株的產(chǎn)酸能力。如圖1所示。

圖1 凍干乳酸菌發(fā)酵過程總酸度和pHFig.1 The fermentation process of total acidity and pH on lactobacillus

由于冷凍干燥對乳桿菌損傷破害的原因，在發(fā)酵前期凍干的乳酸菌產(chǎn)酸能力有所下降，說明凍干燥后乳酸菌的停滯期延長。但總體觀察凍干前后乳酸菌產(chǎn)酸能力來看，凍干后乳酸菌總酸度逐漸增大，同時(shí)pH呈下降趨勢，前4 h酸度增加速率較快，在10 h后趨于穩(wěn)定，表明凍干后乳酸菌發(fā)酵活力良好。

2.4 產(chǎn)香特性

發(fā)酵乳的風(fēng)味主要來自于乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸和各種羰基化合物，其中羰基化合物主要是乙醛和雙乙酰，被認(rèn)為是構(gòu)成發(fā)酵乳風(fēng)味的基礎(chǔ)物質(zhì)。從圖2中可以看出，在發(fā)酵過程中，混合乳酸菌之間的共生關(guān)系在促進(jìn)乳酸菌生長的的同時(shí)，也促進(jìn)雙乙酰和乙醛風(fēng)味物質(zhì)物質(zhì)產(chǎn)量的提高。發(fā)酵4 h后雙乙酰和乙醛開始積累，8 h后產(chǎn)率降低，產(chǎn)量趨于平穩(wěn)。通過圖8pH變化趨勢可以看出，當(dāng)發(fā)酵乳pH在5.0～5.5范圍時(shí)，才有明顯雙乙酰和乙醛的產(chǎn)生。在pH在3.5～4.0范圍時(shí)，雙乙酰和乙醛含量趨于穩(wěn)定。

圖2 乳酸菌發(fā)酵過程雙乙酰和乙醛含量變化趨勢Fig.2 The fermentation process of diacetyl and aldehyde on lactobacillus

2.5 產(chǎn)黏特性

圖3 乳酸菌發(fā)酵過程中黏度和EPS變化趨勢Fig.3 The fermentation process of viscosity and EPS on lactobacillus

發(fā)酵過程中產(chǎn)生微量的黏性物質(zhì)，將有助于改善發(fā)酵乳的組織形態(tài)和黏度，特別是對固形物質(zhì)含量低的發(fā)酵乳尤為重要。發(fā)酵乳黏度增加有兩個(gè)原因：一是酪蛋白增加了發(fā)酵乳的黏稠度，二是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌產(chǎn)生的胞外多糖附著在乳酸菌細(xì)胞及蛋白質(zhì)基質(zhì)上，增加了發(fā)酵乳的黏稠度。由圖2中可以看出，乳酸菌發(fā)酵過程黏度和胞外多糖含量變化趨勢大致相同，表明胞外多糖含量的增加會(huì)促進(jìn)黏度的增大，相關(guān)研究報(bào)道，高產(chǎn)胞外多糖影響發(fā)酵乳的穩(wěn)定性，黏性有關(guān)，可以作為穩(wěn)定劑、增稠劑，改善發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)和口感。有在發(fā)酵后期20 h～24 h黏度和胞外多糖含量下降，說明發(fā)酵時(shí)間對黏度和胞外多糖產(chǎn)量具有影響，發(fā)酵時(shí)間過長會(huì)破壞發(fā)酵乳的黏性和穩(wěn)定性，降低胞外多糖含量。

3 結(jié)論

不同保護(hù)劑對菌種起到不同保護(hù)作用。本研究所選擇15種保護(hù)劑對混合乳酸菌都具有一定的保護(hù)效果，其中脫脂乳和海藻糖保護(hù)效果最為明顯。由于單一保護(hù)劑存在一些缺陷不能高效的保護(hù)菌種，如大分子物質(zhì)只能外部保護(hù)細(xì)胞表面免受損傷，不能滲透到細(xì)胞內(nèi)部使細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度升高，減緩冰晶的生成，從而減少凍干對細(xì)胞內(nèi)部的損傷，因此多種保護(hù)劑復(fù)合使用會(huì)比單一保護(hù)劑的作用更好些。本研究通過正交試驗(yàn)的方法，確定對于選定的混合乳酸菌的最佳冷凍干燥保護(hù)劑配方為甘氨酸1.0%，脫脂乳10.0%，海藻糖7.0%，山梨醇1.0%，此保護(hù)劑使混合乳酸菌的凍干存活率達(dá)到89.1%，且凍干后菌種的產(chǎn)酸、產(chǎn)香能力及產(chǎn)黏特性良好。

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Research of the Cryoprotectant for Composited Lactobacillus

CHEN He-jia，MU Guang-qing*
（School of Food Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning，China）

Abstract：According to the proportion of lactic acid bacteria cryoprotectants preparation ，the strains matching ratio ofStreptococcus thermophils，Lactobacillus bulgaricus，Lactobacillus acidophilusis 3∶2∶1.By the orthogonal test it determine the optimum cryoprotectant formula for composited lactic acid bacteria as：glycine 1.0%，skim milk 10.0%，trehalose 7.0%，sorbitol 1.0%.According to acidity，producing aroma and viscosity of freeze-dried composited lactic acid bacteria culture is good，composite cryoprotectant protective effect is better single cryoprotectants.

Key words：freeze drying；lactobacillus；cryoprotectant

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.18.033

遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2009T013）

陳賀佳（1984—），女（漢），在讀研究生，研究方向：微生物資源與利用。

牟光慶（1967—），男，教授，研究方向：益生菌及蛋白質(zhì)資源開發(fā)利用。

2012-12-20