張 翠，張麗娟，劉占云，劉岱琳，*

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津300193;2.中國人民武裝警察部隊后勤學院生藥教研室，天津300162)

黑豆是我國一種傳統(tǒng)種植的農(nóng)作物，其具有悠久的食用和藥用歷史，自古以來民間就有用黑大豆補血、活血、烏發(fā)養(yǎng)顏的記載。黑豆皮，為豆科植物黑大豆Glycine max(L.)Merr.的干燥成熟種皮，又稱料豆衣、烏衣、櫓豆衣等，有解毒利尿、明目益精、養(yǎng)血疏風之功效，可治療陰虛煩熱、盜汗、眩暈、頭痛、風痹等癥［1］。此外黑豆皮提取物還具有很強的抗氧化活性［2］、抑制誘變［3-4］、抗炎［5］、預(yù)防癌癥［6］等功效。文獻報道黑豆皮中含有大量的花青素、黃酮醇等多種黃酮類成分［7］。有人曾用紫外分光光度法測定藍莓果渣［8］、小飛蓬［9］等樣品中的總黃酮含量，但關(guān)于不同產(chǎn)地的黑豆皮中總黃酮的含量測定方面的研究報道較少。本文在文獻調(diào)研基礎(chǔ)上，采用蘆丁為對照品，硝酸鋁顯色，利用比色法建立了黑豆皮總黃酮的含量測定方法;同時為準確測定黑豆皮中總黃酮的真實含量，利用正交實驗法確定了提取黑豆皮總黃酮的最佳前處理方法。本文的研究結(jié)果考察了測定不同產(chǎn)地黑豆皮中的總黃酮含量，為黑豆皮的綜合開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

八種不同產(chǎn)地的黑豆皮 黃仁黑豆皮(產(chǎn)自湖北)、青仁黑豆皮(產(chǎn)自東北)、KL0901青圓黑豆皮(產(chǎn)自山東濱州市)、KL0902青扁黑豆皮(產(chǎn)自安徽)、有機黃仁黑豆皮(產(chǎn)自東北)、6號黑豆皮(產(chǎn)自鎮(zhèn)川)、7號黑豆皮(產(chǎn)自橫山)、8號黑豆皮(產(chǎn)自山西塑州)，所有黑豆皮樣品均由天津市尖峰天然產(chǎn)物有限公司提供;蘆丁對照品 天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司提供，純度達95%，供含量測定用;乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 均為分析純。

UV-1601型紫外分光光度計 日本島津公司;FA1204B電子天平 上海精科;HH-2數(shù)字顯示恒溫水浴鍋 常州市國華儀器有限公司出產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品0.0286g，置于100mL棕色容量瓶中，加50%乙醇溶解并定容，搖勻即得。

1.2.2 顯色方法［10］取待測溶液1mL，置于25mL容量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，混勻，放置6min，10%硝酸鋁溶液1mL，混勻，放置 6min，4%氫氧化鈉溶液10mL。最后用50%乙醇定容，混勻，放置15min。用1mL 50%乙醇代替對照品溶液按上述方法配制空白溶液。

1.2.3 測定波長的選擇 取對照品溶液1mL，按1.2.2項下方法顯色后，紫外分光光度計在200～800nm進行全波長掃描，結(jié)果如圖1所示。反應(yīng)液在320～510nm期間有明顯的特征峰。為了避開黑豆皮中其他含有苯環(huán)的酚酸類成分的干擾，因此選取可見區(qū)域510nm的特征吸收峰位作為檢測波長。

圖1 對照品的紫外吸收圖Fig.1 UV absorption spectrum of reference material

1.2.4 總黃酮含量標準曲線繪制 精密移取蘆丁標準品0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0、5.0mL 分別置于 25mL棕色容量瓶中，按1.2.2項下操作，在510nm下測定吸光度。每個濃度平行測定三次，取平均值。以蘆丁濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

1.2.5 樣品前處理的最佳提取方法考察 分別稱取9份青圓黑豆皮，每份2.0g，按表L9(34)采用乙醇回流提取的方法進行正交實驗，因素水平見表1。提取液過濾得到濾液并轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用相應(yīng)的溶劑定容，即得黑豆皮總黃酮樣品溶液。準確移取樣品溶液1mL置于25mL容量瓶中，按照1.2.2項下操作，在510nm下測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品中總黃酮濃度。每組樣品平行測定三次，取平均值。

1.2.6 供試品溶液的制備 分別稱取黃仁、青仁、KL0901青圓、KL0902青扁、有機黃仁黑豆皮和6、7、8號黑豆皮樣品，每個樣品稱取3份，每份2.0g，水浴加熱到80℃，按照1.2.5項下確定的最佳前處理提取方法進行提取，過濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，并用相應(yīng)的溶劑定容，即得供試品溶液。

表1 因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal experiment

1.2.7 精密度考察 精密量取對照品溶液1mL，置于25mL容量瓶中，按1.2.2項下操作，在510nm處平行測定吸光度值5次，計算RSD值。

1.2.8 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，按1.2.2項下操作，分別于0、2、4、6、8、10、12h 測定其吸光度，計算RSD值。

1.2.9 重復(fù)性考察 取同一種樣品5份，按1.2.6項下方法制備供試品溶液，按照1.2.2項下操作，在510nm處測定其吸光度，計算RSD值。

1.2.10 加樣回收率實驗 精密吸取同一份供試品溶液5份，每份0.2mL，置于25mL容量瓶中，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL 蘆丁標準品，按照 1.2.2 項下操作，在510nm處測定其吸光度，計算加樣回收率。

1.2.11 樣品總黃酮含量的測定 分別準確移取各供試品溶液0.5mL，按照1.2.2項下操作，在510nm處測定其吸光度A，平行測定三次，代入標準曲線方程得到樣品中總黃酮的濃度C(mg/mL)，根據(jù)公式計算樣品中總黃酮含量。

總黃酮含量(%)=(C×25/0.5)×100/M×100

式中，M為樣品的質(zhì)量(mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量標準曲線

以蘆丁濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程式:Y=12X-0.0009，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，表明蘆丁在0.003～0.057mg/mL范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2 黑豆皮總黃酮樣品前處理的正交實驗結(jié)果

運用統(tǒng)計軟件SPSS11.1對數(shù)據(jù)進行分析，通過對比各因素的極差值(R)可以看出，影響總黃酮含量的因素順序為A＞D＞B＞C。由實驗結(jié)果確定的提取方法為A1B3C2D3，即乙醇的濃度為50%，料液比為1∶20，提取時間為50min，提取次數(shù)為3次。

在最佳樣品提取前處理方法下，進行提取兩次和提取三次的實驗，利用建立的總黃酮測定方法測定，提取三次(8.637%)比提取兩次(6.873%)總黃酮的含量僅增加2%。因此為節(jié)約溶劑，故最終選擇提取兩次。因此，確定最佳提取方法為:乙醇的濃度為50%，料液比為1∶20，提取時間為50min，提取次數(shù)為2次，此時的總黃酮含量為6.873%，比正交實驗中最高組的6.57%高出約0.3%。

表2 正交實驗設(shè)計結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experimental design

表3 正交實驗方差分析結(jié)果Table 3 The result of orthogonal experimental analysis of variance

表4 穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 4 The result of stability tests

2.3 穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性考察結(jié)果見表4，實驗結(jié)果RSD值為1.42%，表明所制備的供試品溶液在12h內(nèi)進行測定穩(wěn)定性良好。

2.4 精密度考察

精密度考察結(jié)果見表5。實驗結(jié)果RSD值為0.39%，表示精密度良好。

表5 精密度考察結(jié)果Table 5 The result of precision tests

2.5 重復(fù)性考察

重復(fù)性考察結(jié)果見表6。實驗結(jié)果的RSD值為1.87%，表示其重復(fù)性良好。

表6 重復(fù)性考察結(jié)果Table 6 The result of repeatability tests

2.6 加樣回收率實驗

結(jié)果如表7所示，平均回收率為104.6%，RSD值為2.41%，表明本法具有良好的回收率。

2.7 不同產(chǎn)地黑豆皮中總黃酮含量的測定

結(jié)果如表8所示，不同產(chǎn)地黑豆皮中總黃酮含量在6.873%～17.017%之間。

表7 加樣回收率實驗結(jié)果Table 7 The result of recovery tests

表8 不同產(chǎn)地黑豆皮中總黃酮含量Table 8 The contents of total flavonoids in black soybean seed coat from different regions

3 結(jié)論與討論

本文首次利用紫外分光光度法測定國內(nèi)不同產(chǎn)地黑豆皮中總黃酮的含量，結(jié)果表明總黃酮含量在6.873%～17.017%之間，其中山西省幾個地區(qū)的黑豆皮含量均較高，此外安徽產(chǎn)地黑豆皮中總黃酮含量也較高。由此可知，不同產(chǎn)地的黑豆皮中總黃酮含量相差較大，可能由于生長環(huán)境如溫度、光照、土壤、水質(zhì)、采收時間、貯藏加工等因素對黑豆皮中總黃酮的形成產(chǎn)生了影響。因此本文的實驗結(jié)果為農(nóng)產(chǎn)品深加工中選取黑豆皮原料深入開發(fā)提供了可以借鑒的參考和實驗依據(jù)，并保證產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)良。

本實驗所采用的總黃酮測定方法中，其反應(yīng)液選取的測定波長為510nm，但黑豆皮自身含有的花青素在510nm可見區(qū)域處也有吸收。為了考察實驗中反應(yīng)液的干擾情況，測定本實驗項下的黑豆皮提取液自身在510nm下的吸光度極低僅為0.003，干擾很小。此外測定時是加入反應(yīng)液實施反應(yīng)后再進行測定，則干擾更低。反應(yīng)液在進行波長掃描時也發(fā)現(xiàn)在200～400nm處也有特征吸收，而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黑豆皮中含有的許多其他酚酸類成分［11］在此區(qū)也有吸收，但其在可見區(qū)域無吸收，為了排除這些成分對實驗的測定結(jié)果的影響，最終采用了510nm為測定波長，保證了測定結(jié)果的準確性。

黑豆皮總黃酮的含量測定方法中樣品的前處理也是至關(guān)重要的，其提取結(jié)果如何，直接影響樣品的測定結(jié)果。因此本文在建立含量測定方法同時利用正交實驗考察了黑豆皮總黃酮的前處理方法:水浴加熱到80℃，用20倍量的50%乙醇加熱回流提取兩次，每次50min，采用此方法黑豆皮總黃酮的提取率為6.873%，此方法保證了黑豆皮中總黃酮的測定結(jié)果能夠真實反映原料的真實含量，為農(nóng)作物黑豆皮的進一步開發(fā)利用奠定堅實的實驗基礎(chǔ)。

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