張振山，劉玉蘭，王娟娟，常云彩

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州 450001；2.河南省科學(xué)院同位素研究所有限責(zé)任公司，鄭州市核農(nóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省輻射加工工程研究中心，河南鄭州450015）

大豆是我國(guó)植物蛋白的主要原料，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。大豆中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物及無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是微生物生長(zhǎng)繁殖的天然培養(yǎng)基，一旦儲(chǔ)藏條件適宜微生物的生長(zhǎng)，微生物就會(huì)迅速的繁殖生長(zhǎng)，進(jìn)而影響大豆的安全儲(chǔ)藏，導(dǎo)致大豆品質(zhì)劣變，還可能產(chǎn)生一些毒素，嚴(yán)重影響它的食用價(jià)值[1]。食品輻照技術(shù)是利用放射源產(chǎn)生的射線(xiàn)對(duì)食品進(jìn)行非熱加工的新技術(shù)。其原理是射線(xiàn)與物質(zhì)相互作用后，將其部分能量傳遞給物質(zhì)的原子或分子，使原子變成離子，離子通過(guò)電離輻射在食品中產(chǎn)生的輻射物理、化學(xué)和生物學(xué)效應(yīng)，達(dá)到殺菌、殺蟲(chóng)、消毒、防腐和防霉的作用，從而延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期、提高食品的質(zhì)量[2]。通常，輻照劑量不超過(guò)10kGy時(shí)，輻照過(guò)的食品被認(rèn)為是安全衛(wèi)生的[3]。但是，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注于高劑量輻照對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)及安全方面的影響[4-5]。然而，目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)高劑量的輻照對(duì)大豆蛋白功能特性影響的研究。本實(shí)驗(yàn)主要利用60Co γ射線(xiàn)研究不同輻照劑量和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)大豆中蛋白含量、溶解性、吸水性、吸油性、乳化性以及乳化穩(wěn)定性的影響。為輻照技術(shù)在大豆加工儲(chǔ)藏方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 購(gòu)于鄭州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，為2011年收獲的國(guó)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大豆，含水量為10.2%，含雜量小于1%；大豆一級(jí)油 中糧北海糧油工業(yè)有限公司，購(gòu)于鄭州丹尼斯超市；正己烷、無(wú)水乙醇、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅等試劑 均為分析純。

HWS-250恒溫恒濕箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FW-80萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；HH-4數(shù)顯攪拌水浴鍋 上海維誠(chéng)儀器有限公司；FA25高速切乳化機(jī) 上海弗克流體機(jī)械制造有限公司；YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；Kjeltec2300凱氏定氮儀 丹麥福斯集團(tuán)；LD5-10低速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆輻照加工 大豆輻照委托河南省科學(xué)院同位素研究所進(jìn)行加工。準(zhǔn)確稱(chēng)取1500g大豆，用自封袋密封，用60Co γ射線(xiàn)在一定輻照劑量下進(jìn)行輻照處理，輻照劑量分別設(shè)為0、10、20kGy。

1.2.2 大豆的儲(chǔ)存 不同輻照劑量處理過(guò)的大豆，置于恒溫培養(yǎng)箱中儲(chǔ)存，儲(chǔ)存溫度28℃，儲(chǔ)存時(shí)間20d。每隔5d取樣200g進(jìn)行大豆?jié)饪s蛋白制備并對(duì)濃縮蛋白特性進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 霉菌總數(shù)的測(cè)定 大豆中霉菌總數(shù)的測(cè)定，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.16-2003進(jìn)行。

1.2.4 濃縮蛋白的制備 輻照后的大豆用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩，篩下物用正己烷脫脂，脫脂粕離心分離后，自然風(fēng)干至無(wú)溶劑氣味。濃縮蛋白的制備參照劉玉蘭等[6]報(bào)道的方法并略作修改，取一定量干燥后的脫脂粕與65%的乙醇溶液混合（固液比1∶7），在提取溫度50℃下，攪拌提取60min后，真空抽濾分離。分離后的蛋白粉與90%的乙醇溶液混合（固液比1∶7），在提取溫度70℃下，攪拌提取60min后，真空抽濾分離。分離出的大豆粕即為大豆?jié)饪s蛋白，自然干燥脫溶后，密封放入-20℃冰箱待用。

1.2.5 粗蛋白含量的測(cè)定 大豆中粗蛋白含量的測(cè)定，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14489.2-2008進(jìn)行。

1.2.6 氮溶解指數(shù)（NSI）的測(cè)定 大豆中蛋白氮溶解指數(shù)的測(cè)定，參照AACC 46-23方法進(jìn)行。

1.2.7 吸水性的測(cè)定[7]準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2g濃縮蛋白，置于10mL離心管中。加入6mL蒸餾水，振蕩1min后靜置10min。然后在1600r/min下離心25min，除去澄清水。吸水性（WHC）以每克蛋白結(jié)合水的克數(shù)表示。

1.2.8 吸油性的測(cè)定[8]準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g濃縮蛋白，置于10mL離心管中。加入5mL一級(jí)大豆油，每5min振蕩30s，30min后在1600r/min下離心25min，棄去上層未吸附油。吸油性（OAC）以每克蛋白吸油的克數(shù)表示。1.2.9 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定[9]精確稱(chēng)取1.0g大豆?jié)饪s蛋白到100mL燒杯中，加入20mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為7.0，再加入20mL一級(jí)大豆油，均質(zhì)1min（1500r/min），放入離心機(jī)中離心5min（1300r/min），取出離心管，觀(guān)察乳化情況，記錄乳化層高度及管中液體總高度，計(jì)算乳化能力（EA），見(jiàn)式（1）。

將上述離心管置于80℃水浴中加熱30min后，用自來(lái)水冷卻至室溫，再次離心5min，記下乳化層高度及管中液體總高度，計(jì)算乳化穩(wěn)定性（ES），見(jiàn)式（2）。

式中：H0-離心管中乳化層的高度；H-離心管中液體總高度。

式中：H1-加熱冷卻后管中乳化層高度；H2-加熱冷卻后管中液體總高度。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS（V16.0）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測(cè)定結(jié)果表示為平均數(shù)（n≥3），采用ANOVA檢驗(yàn)對(duì)影響因素進(jìn)行顯著性分析，以p＜0.05為顯著性水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 輻照對(duì)霉菌總數(shù)的影響

圖1 輻照劑量和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)菌落數(shù)的影響Fig.1 Effect of irradiation dose levels and storage time on the number of colonies

從圖1可以看出，輻照對(duì)大豆中的菌落數(shù)具有顯著的影響（p＜0.01），隨著輻照劑量的加大，菌落數(shù)顯著減少，這說(shuō)明輻照具有很好的殺菌保鮮效果。10kGy和20kGy輻照后的大豆，菌落總數(shù)差別不大，這是因?yàn)?0kGy的輻照量已經(jīng)可以殺死附著于大豆表面的大部分微生物，單就保鮮而言，大豆輻照劑量不應(yīng)超過(guò)10kGy。

同時(shí)，可以看出，在貯藏前10d內(nèi)，菌落數(shù)的增加量較小，變化平緩；在貯藏時(shí)間超過(guò)10d后，檢測(cè)的菌落數(shù)量驟然上升，變化幅度較大，特別是未經(jīng)輻照的大豆，變化趨勢(shì)尤為明顯。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析發(fā)現(xiàn)，菌落數(shù)隨儲(chǔ)存時(shí)間呈指數(shù)增加。

2.2 輻照對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響

圖2 輻照劑量和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of irradiation dose levels and storage time on crude protein content

從圖2可以看出，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆中粗蛋白干基含量不斷增加。這一方面可能是由于儲(chǔ)存過(guò)程中，大豆上的霉菌分解了碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)成分，造成干物質(zhì)總量的減少。另一方面，則可能是由于霉菌繁殖過(guò)程中吸收了空氣中的N2產(chǎn)生了非蛋白氮，而粗蛋白檢測(cè)是以測(cè)定原料含氮量為基礎(chǔ)。此外，霉菌的分解作用也會(huì)使結(jié)合蛋白得到更多的釋放。這一研究結(jié)果與已有報(bào)道的結(jié)果相符[10]。

同時(shí)，從圖2還可以看出，隨著輻照劑量的增加，粗蛋白干基含量不斷降低。這可能是由于輻照殺死了大豆中的霉菌，而且輻照劑量越大，殺菌效果越好；霉菌數(shù)量的減少，使由霉變?cè)斐傻母晌镔|(zhì)損耗量也越少。

2.3 輻照對(duì)大豆NSI的影響

圖3 輻照劑量和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)大豆NSI的影響Fig.3 Effect of irradiation dose levels and storage time on nitrogen solubility index

從圖3可以看出，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆中蛋白的NSI值略有降低，這主要是因?yàn)槊棺儗?duì)蛋白質(zhì)品質(zhì)產(chǎn)生了影響。通常霉變程度越高，蛋白質(zhì)的溶解度越低[11]。同時(shí)，從圖3中還可以看出，輻照后大豆蛋白的NSI值明顯提高。這可能是由于適量的輻照可以破壞分子間的非共價(jià)鍵，從而使不溶性蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白。但是，與輻照劑量10kGy相比，輻照劑量20kGy下所得大豆的NSI略低。這一方面可能是由于高劑量的輻照導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，以及蛋白質(zhì)分子聚合；另一方面可能是由于輻照導(dǎo)致蛋白質(zhì)與其他成分之間發(fā)生了美拉德反應(yīng)[12-13]。

2.4 輻照對(duì)蛋白吸水性的影響

圖4 輻照劑量和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)蛋白吸水性的影響Fig.4 Effect of irradiation dose levels and storage time on the water absorption of protein

從圖4可以看出，輻照對(duì)大豆蛋白的吸水性并沒(méi)有顯著的影響（p＞0.05），與未輻照的大豆相比，輻照后的大豆所得濃縮蛋白的吸水性略有降低。這可能是由于輻照使得蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，使原本隱藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來(lái)，導(dǎo)致可用于約束水的極性氨基減少[12]。另外，輻照引起蛋白分子聚集也會(huì)導(dǎo)致吸水性的降低。同時(shí)，從圖4還可以看出，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白的吸水性略有降低。這可能是由于霉變導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性引起的。

2.5 輻照對(duì)蛋白吸油性的影響

圖5 輻照劑量和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)蛋白吸油性的影響Fig.5 Effect of irradiation dose levels and storage time on the oil absorption of protein

從圖5可以看出，輻照處理后的大豆所制備的濃縮蛋白吸油性顯著提高（p＜0.05）。這可能是由于輻照使得蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵發(fā)生斷裂，形成巰基，使疏水性基團(tuán)暴露，從而吸油性有所增加[7]，莫耽等在研究輻照對(duì)大豆中分離蛋白功能特性影響時(shí)得到了與此相似的結(jié)果。同時(shí)，從圖5中還可以看出，在儲(chǔ)存時(shí)間低于10d時(shí)，蛋白的吸油性隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加。這可能是由于霉菌活動(dòng)分解了碳水化合物，使制備的濃縮蛋白具有更高的蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)含量的增加使?jié)饪s蛋白的吸油性提高。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，盡管蛋白質(zhì)含量有所提升，但是，更多的蛋白質(zhì)發(fā)生變性抵消了吸油性增長(zhǎng)的部分。

2.6 輻照對(duì)蛋白乳化性的影響

圖6 輻照劑量和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)蛋白乳化性的影響Fig.6 Effect of irradiation dose levels and storage time on protein emulsification

從圖6可以看出，輻照有助于提高大豆蛋白的乳化性，然而過(guò)高的輻照劑量又會(huì)使大豆蛋白的乳化性降低。這可能是由于輻照加工使原本隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，進(jìn)而增強(qiáng)了疏水性多肽部分與油脂類(lèi)的結(jié)合，以及極性基團(tuán)與水的結(jié)合，最終導(dǎo)致濃縮蛋白乳化性的增強(qiáng)[14]。隨著輻照劑量的繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，蛋白質(zhì)乳化性開(kāi)始降低。霉變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變性，因此，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白乳化性逐漸降低。

2.7 輻照對(duì)蛋白乳化穩(wěn)定性的影響

從圖7可以看出，輻照對(duì)大豆蛋白乳化穩(wěn)定性的影響和其對(duì)大豆蛋白乳化性的影響相似。與未輻照的相比，經(jīng)過(guò)10kGy輻照的大豆其蛋白的乳化穩(wěn)定性提高了約4.5%，經(jīng)過(guò)20kGy輻照的大豆其蛋白的乳化穩(wěn)定性提高了約3.3%。這說(shuō)明適量的輻照有助于提高大豆蛋白的乳化穩(wěn)定性，這一結(jié)果與已有的報(bào)道[7]相符。同時(shí)，研究表明，隨著大豆霉變程度的加深，濃縮蛋白的乳化穩(wěn)定性逐漸降低。因此，利用大豆蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性可以衡量輻照處理大豆的品質(zhì)。

圖7 輻照劑量和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)蛋白乳化穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of irradiation dose levels and storage time on emulsion stability of protein

3 結(jié)論

適當(dāng)劑量的輻照處理，可以有效地殺死大豆中的霉菌，延長(zhǎng)大豆的保質(zhì)期。輻照處理后的大豆其蛋白質(zhì)除吸水性有所降低之外，其他功能特性如，氮溶指數(shù)、吸油性、乳化性以及乳化穩(wěn)定性等均有所提高。但是，過(guò)量的輻照處理，會(huì)對(duì)大豆的品質(zhì)造成損害，使其功能特性指標(biāo)降低。研究結(jié)果還表明，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，輻照過(guò)的大豆其蛋白質(zhì)功能特性變化趨勢(shì)與未輻照的大豆一致。

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