張景強(qiáng)，李清春，*，張奇志，鄧煥英，孫延一

（1.電子科技大學(xué)中山學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣東中山 528402；2.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510507）

香蕉多糖的提取和色譜分析

張景強(qiáng)1，李清春1，*，張奇志2，鄧煥英2，孫延一1

（1.電子科技大學(xué)中山學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣東中山 528402；2.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510507）

摘 要：香蕉多糖的研究尚處于起步階段，本文探討了冷熱交替處理、纖維素酶和果膠酶混合酶解處理等預(yù)處理技術(shù)對(duì)多糖得率影響，并以脫蛋白、透析等技術(shù)提高多糖純度。采用提取工藝為：成熟香蕉→剝皮、切段→高溫滅酶→粉碎打漿→冷處理（4℃～8℃，1 h）、熱處理（40℃，20 min）→混合酶作用（48℃，2 h）→熱水浸提（90℃，3h）→乙醇沉淀→脫蛋白→透析→低溫真空干燥，制得的香蕉多糖純度達(dá)到70.29%。以離子色譜儀分析香蕉多糖的水解液，數(shù)據(jù)顯示組成香蕉多糖的單糖主要是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，它們的物質(zhì)的量之比為0.11∶0.05∶0.67∶0.07∶0.10。

關(guān)鍵詞：香蕉多糖；提取工藝；色譜分析

最新研究發(fā)現(xiàn)糖類(lèi)在生物體中的作用不僅是作為能量資源或結(jié)構(gòu)材料，更重要的是廣泛地參與細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝、胚胎發(fā)育、細(xì)胞癌變、病毒感染、免疫應(yīng)答等細(xì)胞活動(dòng)，具有多種多樣的生物學(xué)功能[1]。其中，一些分子量在幾千以上，具有很強(qiáng)生物活性的多糖更是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和食品功能化學(xué)共同關(guān)注的焦點(diǎn)。多糖在自然界中分布很廣，具有增強(qiáng)免疫功能、抗輻射、抗腫瘤、抗炎、降血糖等生物學(xué)活性，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)多糖的研究主要集中在藥用植物多糖和真菌多糖，而對(duì)日常果蔬中的多糖研究相對(duì)較少[2]。

香蕉，屬巴蕉科（Musaeae），巴蕉屬（musa），為草木果樹(shù)。我國(guó)香蕉資源豐富，年產(chǎn)量超800萬(wàn)t。香蕉作為常見(jiàn)的果實(shí)，其食用、藥用價(jià)值極高，但目前對(duì)香蕉的研究開(kāi)發(fā)主要集中在香蕉的生產(chǎn)和粗加工上，如加工成香蕉酒、香蕉飲料、香蕉干等，而其藥用價(jià)值往往被忽略。香蕉中含糖量近20%，許多研究證明，香蕉多糖是香蕉的主要活性成分，具有免疫活性、抗氧化活性及抗腫瘤作用等[3-5]，具有廣闊的應(yīng)用發(fā)展空間。本文研究了香蕉多糖的提取工藝，并對(duì)所得香蕉多糖進(jìn)行了水解分析，為香蕉多糖的下一步應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉：市售，皮上有少許黑點(diǎn)的成熟香蕉；纖維素酶、果膠酶：上海伯奧生物科技有限公司。

1.2 儀器

RE-300B0旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；GL-20C高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；BZF-30真空干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；UV-Vis 2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津制作所；ICS-3000離子色譜分析儀：美國(guó)戴安公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香蕉預(yù)處理

將香蕉剝皮、切成1 cm左右的小段，以高溫蒸汽滅酶（105℃，10 min），以粉碎機(jī)打碎后制成的漿狀樣品作為對(duì)照樣品備用；取適量漿狀樣品放入4℃～8℃冰箱中冷藏1 h，取出后在40℃水浴中保溫20 min，得到冷熱交替處理的樣品。配制0.05%的纖維素酶和果膠酶的混合酶液（纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比為1∶1），取適量冷熱交替處理的樣品，按照0.1%的質(zhì)量比加入混合酶液，在48℃恒溫下酶解2 h，得到混合酶處理的樣品。

1.3.2 香蕉多糖的提取

在上述酶解作用后的香蕉漿中加入4倍體積水，在90℃水浴中回流浸提3h，過(guò)濾后殘?jiān)碛茫脼V液上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原體積的1/4，再加入4倍體積的無(wú)水乙醇，于4℃～8℃低溫下過(guò)夜沉淀；離心（5 000 r/min，10 min）后所得沉淀，加少許水溶解后，再加入4倍體積的無(wú)水乙醇低溫下過(guò)夜沉淀，離心后所得沉淀用丙酮脫水2次，于真空干燥箱中烘至恒重。所得多糖即為香蕉粗多糖。

1.3.3 脫蛋白處理

香蕉粗多糖中含有少量游離蛋白質(zhì)，需要進(jìn)行脫蛋白處理，分別以三氯乙酸、Sevag試劑（200 mL氯仿與40 mL正丁醇混合）、三氯乙酸+丁醇（200 mL三氯乙酸與10 mL正丁醇混合）來(lái)除去蛋白質(zhì)。以多糖溶液在280 nm處的吸光度值來(lái)衡量脫蛋白的效果[6]。

1.3.4 透析處理

將透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度，煮沸10 min，以蒸餾水清洗后備用。將多糖濃縮液裝入透析袋中，排除空氣，用棉線(xiàn)扎口，懸掛在清水容器中，在低溫4℃～8℃下用蒸餾水透析48 h。之后取出，在低溫下真空干燥至恒重即得到香蕉多糖成品。

1.3.5 香蕉多糖含量的檢測(cè)

采用苯酚-硫酸法檢測(cè)香蕉多糖中的多糖含量[7]。

精確稱(chēng)葡萄糖（AR）1.000 0 g，溶解后，于 100 mL容量瓶中定容，配制成濃度為10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液，分別取 1.25、2.50、3.75、5.00、6.25、7.50 mL 于25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，分別得到濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精確吸取上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL于10 mL具塞比色管中，同時(shí)取2.00 mL蒸餾水作為空白，分別加入5%的苯酚溶液1.00mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.00mL，振搖5min，沸水浴加熱15min后于冰水浴冷卻10min，在波長(zhǎng)489 nm下檢測(cè)其吸光度值A(chǔ)，建立A～c標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理得：A=0.2273c+0.0558，r=0.9996。

1.3.6 香蕉多糖的理化性質(zhì)檢測(cè)

精確稱(chēng)取香蕉多糖0.100 0g于100 mL容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，配成1 mg/mL濃度的香蕉多糖溶液。

1.3.6.1 碘-碘化鉀反應(yīng)

取1 mL上述多糖溶液，加入碘-碘化鉀溶液，觀(guān)察顏色變化。

1.3.6.2 茚三酮反應(yīng)

取1 mL上述多糖溶液，加入0.5 mL 0.1%茚三酮乙醇溶液，混勻，煮沸1min～2min，冷卻，觀(guān)察顏色變化。

1.3.6.3 Molish反應(yīng)

取1 mL上述多糖溶液，加入2滴Molish試劑即10%的α-萘酚的乙醇溶液，混合均勻后將試管傾斜45°，沿試管壁慢慢加入1 mL濃硫酸（勿搖動(dòng)），豎立試管，觀(guān)察濃硫酸和糖交界面顏色的變化。

1.3.7 香蕉多糖的水解

精確稱(chēng)取干燥好的香蕉多糖0.030 5 g，加入6.5%的硫酸20mL，在105℃下水解2.5h，水解液移入100mL容量瓶中，調(diào)pH至7.0，以蒸餾水定容至刻度。

1.3.8 香蕉多糖的離子色譜分析[8]

多糖水解產(chǎn)物上美國(guó)戴安公司的ICS-3000離子色譜儀進(jìn)行分析。儀器條件為：脈沖安培檢測(cè)器（PAD），AS40自動(dòng)進(jìn)樣器，保護(hù)柱為CarboPacTM PA1 guard（2×50 mm），色譜柱為 CarboPacTM PA1 column（2×250mm）。淋洗液為100mmol/L的NaAC和2mmol/L的NaOH混合液，淋洗液流速為0.25 mL/min，進(jìn)樣量為50 μL；分析軟件為變色龍6.8中文版。以峰面積（Peak area）值計(jì)算產(chǎn)物濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 冷熱交替處理對(duì)香蕉多糖提取的影響

將香蕉打漿，采取先冷藏后加熱的交替處理可破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，有利于后續(xù)的浸提工藝來(lái)提取多糖。經(jīng)冷熱交替處理樣品的多糖得率和多糖含量均優(yōu)于對(duì)照樣品，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 冷熱交替處理對(duì)香蕉多糖得率、含量的影響Table 1 Enhancement of yield&purity of banana polysaccharide by pretreatment alternating hot and cold

從表1可知，采用冷熱交替的預(yù)處理后，香蕉多糖的得率從0.23%提高到0.40%，是對(duì)照處理樣品的1.74倍；多糖含量從18.91%提高到30.76%，是對(duì)照處理樣品的1.63倍。

2.2 混合酶處理對(duì)香蕉多糖提取的影響

香蕉細(xì)胞壁中含有大量纖維素和果膠質(zhì)物質(zhì)，會(huì)阻礙香蕉多糖的提取。通過(guò)纖維素酶和果膠酶組成的混合酶液的預(yù)處理，可以降解并破壞香蕉細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)容物最大限度地釋放出來(lái)，從而大大提高香蕉多糖的得率。表2是采用混合酶處理對(duì)香蕉多糖得率和多糖含量的影響。

表2 混合酶處理對(duì)香蕉多糖得率、含量的影響Table 2 Enhancement of yield&purity of banana polysaccharide by mixed enzymes hydrolysis

從表2可知，在冷熱交替的預(yù)處理的基礎(chǔ)上，再采用混合酶預(yù)處理，香蕉多糖的得率和多糖含量進(jìn)一步提高。其中香蕉多糖得率進(jìn)一步從0.40%提高到0.61%，是冷熱交替處理樣品的1.53倍；多糖含量從30.76%提高到46.90%，是冷熱交替處理樣品的1.52倍。

綜合表1和表2可知，冷熱交替處理結(jié)合混合酶處理的預(yù)處理方式，可有效破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，大大提高香蕉多糖得率和多糖含量，其中香蕉多糖得率是對(duì)照樣品的2.65倍，多糖含量是對(duì)照樣品的2.48倍。

2.3 不同脫蛋白試劑的脫蛋白效果

三種脫蛋白試劑去除香蕉多糖中游離蛋白質(zhì)的效果有較大差別，其中以三氯乙酸和正丁醇的混合液的去除效果最好，處理后的香蕉多糖含量達(dá)到62.43%，多糖溶液在280 nm處的吸光值很小，僅僅為0.102。

表3 不同脫蛋白試劑的處理效果Table 3 Effect of three deproteinized reagents

2.4 透析處理對(duì)香蕉多糖含量的影響

香蕉多糖的純度越高，其生物活性作用越高。脫蛋白處理香蕉多糖純度可達(dá)到62.43%，透析處理后，除去了其中的一些小分子雜質(zhì)，多糖的純度進(jìn)一步提高。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1中數(shù)據(jù)顯示，透析48 h后樣品中香蕉多糖含量可達(dá)到70.29%，比透析前提高了12.59%。

圖1 透析前后香蕉多糖的含量Fig.1 Banana polysaccharide content before and after dialysis

2.5 香蕉多糖理化性質(zhì)

分離純化后的香蕉多糖易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑。理化性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果為苯酚-硫酸反應(yīng)呈陽(yáng)性，碘-碘化鉀反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)均呈陰性，說(shuō)明樣品中不含淀粉、氨基酸和蛋白。而Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，說(shuō)明樣品是非淀粉糖。因此，香蕉多糖經(jīng)分離純化后，純度高，屬于水溶性中性多糖。

2.6 香蕉粗多糖水解液的離子色譜分析

分別稱(chēng)取適量色譜純的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，均配制成濃度為5 μg/mL的混合溶液，上離子色譜儀后得到以下色譜圖2。同時(shí)，將處理好的香蕉多糖水解液也上離子色譜儀得到圖3。

圖2 五種標(biāo)準(zhǔn)單糖的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of five standard monosaccharides

圖3 香蕉多糖水解液的離子色譜圖Fig.3 Ion chromatogram of hydrolyzate of banana polysaccharide

圖2中各標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間分別為：阿拉伯糖（7.267 min）、半乳糖（9.167 min）、葡萄糖（10.667 min）、木糖（12.700 min）、甘露糖（13.617 min）。

圖3中香蕉多糖水解液的離子色譜圖有5個(gè)峰，其保留時(shí)間分別為 7.233 min、9.117 min、10.533 min、12.567 min、13.483 min。與圖2中標(biāo)準(zhǔn)單糖色譜峰比對(duì)，可知圖3中的峰1為阿拉伯糖、峰2為半乳糖、峰3為葡萄糖、峰4為木糖、峰5為甘露糖。

通過(guò)峰面積定量計(jì)算可得，香蕉水解液中各單糖的濃度分別為：阿拉伯糖1.762 μg/mL、半乳糖0.995 μg/mL、葡萄糖 12.606 μg/mL、木糖 1.075 μg/mL、甘露糖1.829 μg/mL。香蕉多糖的組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖等五種單糖，其物質(zhì)量的比為 0.11∶0.05∶0.67∶0.07∶0.10。

3 結(jié)論

香蕉多糖的研究尚處于起步階段，選擇合適的香蕉多糖提取工藝可獲得高純度多糖。本文的提取工藝為：成熟香蕉→剝皮、切段→高溫滅酶→粉碎打漿→冷處理（4℃～8℃，1 h）、熱處理（40℃，20 min）→混合酶作用（48℃，2 h）→熱水浸提（90℃，3 h）→乙醇沉淀→脫蛋白→透析→干燥得成品，本工藝所制得香蕉多糖純度可達(dá)到70.29%。將香蕉多糖的水解液上離子色譜儀分析其組成可知，組成香蕉多糖的單糖主要是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，它們的物質(zhì)的量之比為 0.11∶0.05∶0.67∶0.07∶0.10。

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The Extraction of Banana Polysaccharide and Chromatography Analysis

ZHANG Jing-qiang1，LI Qing-chun1，*，ZHANG Qi-zhi2，DENG Huan-ying2，SUN Yan-yi1
（1.College of Chemistry&Biology Engineering，University of Electronic Science and Technology of China Zhongshan Institute，Zhongshan 528402，Guangdong，China；2.Guangdong AIB Polytechnic College，Guangzhou 510507，Guangdong，China）

Abstract：The study on banana polysaccharide is still on its primary stage.In this paper， some pretreatments of extraction， such as cold&hot treatment， mixed enzymatic treatment （cellulase mixed with pectinase）， were adopted to improve the yield of banana polysaccharide.At the same time， some purification technologies， such as deproteinization， dialysis bag， were adopted to enhance the purity of banana polysaccharide.The adopted extraction process is：ripe banana skinned&cut→ enzyme inactivation→ crushed&pulping→ cold treatment（4℃～8℃，1 h），heat treatment（40℃，20 min）→ mixed enzymatic treatment（48℃，2 h）→ extraction in hot water （90℃，3h）→ precipitation in ethanol solution→ deproteinization→ dialysis→ drying（cryogentic vacuum）.The purity of obtained banana polysaccharide is as high as 70.29%.The hydrolysis solution of banana polysaccharide was analyzed by ion chromatograph.The results were showed that banana polysaccharide was mainly composed of arabinose，galactose，glucose，xylose and mannose，and their molar ratio was 0.11∶0.05∶0.67∶0.07∶0.10.

Key words：banana polysaccharide；extraction process；chromatography analysis

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.021

廣東省中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（20103A249）；電子科技大學(xué)中山學(xué)院科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（409YKQ07）

張景強(qiáng)（1974—），男（漢），講師，博士，從事資源化學(xué)與食品分析研究。

李清春（1975—），女（漢），講師，碩士，從事食品發(fā)酵與功能食品研究。

2013-02-17