李三棟，丁 軻,*，羅偉光，彭春平，孫二剛，劉永壘

（1.河南科技大學宏翔發(fā)酵飼料實驗室，河南 洛陽 471003；2.河南宏翔生物科技有限公司，河南 汝州 467500）

蛋白酶廣泛存在于人和動物的消化道中，對蛋白質的消化吸收起著至關重要的作用。豬日糧中蛋白質含量一般為13%～17%，蛋白質能被消化降解多少將直接影響著動物生產(chǎn)性能和經(jīng)濟效益，而蛋白質必需經(jīng)過蛋白酶降解成短肽或氨基酸后才能被動物利用。一般成年豬能夠分泌足夠的蛋白酶消化蛋白質，但仔豬消化機能尚未發(fā)育完全，蛋白酶分泌量不足，在一定程度上影響了其生長速度，所以在仔豬日糧中添加外源蛋白酶不但能補充體內內源酶不足，而且能激活內源酶分泌，將蛋白質分解成多肽、寡肽或氨基酸等，有利于仔豬對蛋白質的消化分解和吸收利用。目前雖然已開發(fā)出多種蛋白酶制劑，但由于菌種酶活力低、生產(chǎn)成本高，因而有關蛋白酶飼料營養(yǎng)方面有待進一步研究。本試驗從不同地區(qū)來源的豬糞樣品中分離產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌，旨在篩選高產(chǎn)蛋白酶菌株，同時也篩選適合作為飼料添加劑的產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌，為實踐中提供產(chǎn)酶益生菌奠定基礎。

1 試驗材料

1.1 試驗樣品

分別從河南省各地區(qū)采集豬糞便樣品80份。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：酪蛋白0.5%，脫脂奶粉0.5%，酵母膏0.2%，瓊脂2%，調pH至7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，蛋白胨0.5%，瓊脂1.5%，調pH至7.5。

1.3 主要試劑

微量生化發(fā)酵管：葡萄糖、蔗糖等36種發(fā)酵管購自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR試劑：Taq酶（5 U·μL-1）、DL2000、Goodview、瓊脂糖凝膠均購自北京方寶生物科技有限公司；引物：參考芽孢桿菌的16S rDNA序列設計一對引物，由上海生物工程有限公司合成，P1：5'-CTGCAGCTA CC GGTCGCCACCATG-3'， P2： 5'-GAATTCTTAC TT GTACAGCTCGTCCATG-3'。

2 試驗方法

2.1 樣品采集及處理

將分別從河南省各地區(qū)采集豬糞便樣品80份裝入樣品袋內，4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ悠芳s1 g加入10 mL無菌水中，制成10%的混懸液，80℃水浴熱處理30 min。

2.2 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩、純化

將處理過的上清液稀釋到一定濃度，取200 μL涂布于分離培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)24 h，挑選能產(chǎn)生酶解圈的菌落，革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢初步認為是芽孢桿菌的，再進行純化培養(yǎng)。

2.3 復篩

取純化的菌液2 μL在分離培養(yǎng)基上滴種，置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察并測量各菌株酶解圈和菌落直徑，通過比較其比值大小，初步篩選出高產(chǎn)蛋白酶菌株。

2.4 蛋白酶活力測定

采用福林酚（Folin）法測定酶比活力，蛋白酶酶活力單位定義為在一定溫度和pH條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生酪氨酸1 μg為1個酶活力單位（U）。

2.5 菌株的生化試驗

將上述篩選的菌株接種到微量發(fā)酵管，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，觀察并記錄試驗結果，以標準枯草芽孢桿菌（Bacillus ATCC6633）為對照。

2.6 16S rDNA的鑒定

提取芽孢桿菌基因組，并以此為模板，反應體系為：10×PCR buffer 5 μL，MgCl22.5 μL，dNTP（10 mM）2 μL，上游引物（10 mM）2 μL，下游引物（10 mM）2 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 38μL。反應參數(shù)：94 ℃，3 min→（94℃，50 sec→55℃，90 sec→72℃，90 sec，30 cycles）→72 ℃，10 min→4 ℃。取 5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳觀察結果[4]。

2.7 序列分析

將上述PCR產(chǎn)物送至中美泰和生物技術（北京）有限公司測序，然后將所測序列提交到NCBI網(wǎng)站（美國國立生物技術中心網(wǎng)站）進行blast同源性分析。

3 試驗結果

3.1 菌株初篩結果

通過菌株的菌落特征、顯微特征和酶解圈的大小，初步分離得到86株產(chǎn)蛋白酶的菌株（部分菌株顯微形態(tài)見圖1～2）。

圖1 部分菌株顯微特征

圖2 部分菌株顯微特征

3.2 復篩

通過在分離培養(yǎng)基上滴種，比較酶解圈直徑（H）與菌落直徑（C）比值的大小，初步篩選出高產(chǎn)菌株，結果見附表和圖3。

附表 蛋白酶產(chǎn)生菌的酶解圈結果

圖3 部分菌株平板復篩選結果

3.3 菌株生理生化鑒定

結果表明，B.A464能氧化利用β-半乳糖苷、阿拉伯糖、甘露糖等，不能利用山梨糖、淀粉、葡萄糖酸鹽等，根據(jù)形態(tài)特征觀察及生理生化鑒定結果，參照伯杰氏細菌鑒定手冊和常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊該菌株基本符合蠟樣芽孢桿菌的主要特征。因此初步鑒定B.A464為蠟樣芽孢桿菌。

3.4 16S rDNA鑒定結果

3.4.1 PCR擴增結果

PCR擴增結果表明，該菌株的16S rDNA序列大小約為1 500 bp，與預期大小一致，結果見圖4。

圖4 PCR產(chǎn)物電泳結果

3.4.2 序列測定和序列進化樹分析結果

經(jīng)測序得16S rDNA序列長度為1 463 bp，與預期結果一致。將上述序列提交到美國國立生物信息中心（NCBI）進行Blast，結果見圖5。

圖5 B.A464序列進化樹

由圖5可知，菌株B.A464與蠟樣芽孢桿菌Bacil?lus cereus親緣關系最近，同源性比對結果表明，該株菌與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus 08001）的同源性為99%。

4 討論

蛋白酶是一種作用于飼料中主要成分蛋白質的酶制劑，其在一定程度上可以幫助動物消化、降解飼料中的高分子蛋白質，對提高生產(chǎn)性能起很大作用，尤其是在幼齡動物上應用效果更為顯著，已在仔豬、雛雞等的生產(chǎn)實踐中取得良好效果。

芽孢桿菌是一類產(chǎn)酶性能較強的微生物，而且一般芽孢桿菌又具有耐熱、耐酸和耐膽鹽的特性，很適合作為飼料添加劑。因此本研究通過采集大量樣品進行篩選，并從中獲得一株蛋白酶活性較高菌株B.A464，其酶活力可達2.19×103U·mL-1。李超敏等報道的嗜堿芽孢桿菌酶活力可達63.5 U·mL-1[1]。孫同毅等報道的產(chǎn)堿性蛋白酶嗜堿芽孢桿菌HAP的酶活力高達1.22×104U·mL-1[2]。但這些菌株大都是堿性蛋白酶，且產(chǎn)量和酶學性質都不能滿足畜牧業(yè)發(fā)展的需求。因此，相比較而言，本研究所分離菌株B.A464屬于酶活性較高的菌株，很適合作為蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)的菌種和作為動物微生物飼料添加劑。而且本試驗分離出的蛋白酶菌株B.A464是一種中性產(chǎn)蛋白酶菌株，雖然酶活力并不是目前報道最高的，但是因其同時具備了作為益生菌的多種性能，所以是一株很有應用潛力的菌株。下一步將對其作進一步誘變以提高其酶活力，同時對該菌的產(chǎn)酶條件和酶學性質做深入研究，為其臨床應用奠定基礎。

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