王麗榮，程福亮，陳 雷，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

蛋白質的生化分析和基因表達產物的分離純化中，難免會需要分離某種或某些小分子蛋白質成分。近年來，用電泳法測定小分子多肽分子量的研究報道較少。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）方法用作蛋白質相對分子質量測定的技術最早由Shapiro等于20世紀60年代建立，隨后Weber等進行了改進，顯示出了該方法在分離鑒定和純化蛋白質方面的優(yōu)越性。隨著生物技術的飛速發(fā)展和基因工程藥物的大量涌現(xiàn)，具有高生物活性小分子多肽的分離、純化和鑒定已顯得尤為突出，而小分子多肽相對分子質量的測定，目前多采用Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)，但系統(tǒng)中的Tricine價格昂貴，電泳時間較長，且由于小分子多肽相對分子質量小，易受電泳緩沖系統(tǒng)、凝膠濃度、電泳時間、染色和脫色等的影響，極易引起條帶擴散、不易著色，使分辨率降低，因而直接影響多肽相對分子質量的測定[1-2]。現(xiàn)有多肽相對分子質量的3層膠電泳測定方法操作復雜。張曉楠等采用尿素SDS-PAGE法快速測定相對分子質量為2 500～17 000的多肽[3]。石繼紅等也分別對小分子肽類進行測定[4]。

轉移因子（TF）屬于淋巴因子，可特異或非特異性地調節(jié)機體免疫狀態(tài)、增強其細胞免疫和骨髓造血功能，已在臨床應用多年，在原發(fā)性免疫缺陷病或慢性病毒感染疾病中作為免疫治療藥物作用，目前已得到肯定，特別是對病毒性上呼吸道感染治療取得良好效果[5]。主要成分為小分子多肽和核苷酸，為免疫調節(jié)劑。本研究根據(jù)小分子多肽條帶分辨率高、操作簡便、分析時間少、低成本等原則，改進低相對分子質量蛋白——轉移因子的尿素-SDS-PAGE方法，并為小分子多肽相對分子質量的測定提供有效方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

垂直電泳儀及其配件、Power PAC200穩(wěn)壓穩(wěn)流電源由Bio-Rad公司生產；GDS28000凝膠圖像處理系統(tǒng)由英國UVP公司生產。低分子量蛋白Marker購自北京天恩澤基因科技有限公司；小分子多肽樣品由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

1.2 試劑及配制

30%丙烯酰胺：稱取丙烯酰胺29 g和N,N'-亞甲雙丙烯酰胺1 g溶于超純水80mL中，定容至100 mL。0.45μm濾膜過濾后，測定pH。10%SDS：稱取SDS 10 g溶于超純水80mL中，定容至100 mL。1.5 mol·L-1Tris-CL：稱取 Tris-Base 18.171 g溶于超純水80mL中，用濃鹽酸調整pH至8.8，定容至 100 mL。0.5 mol·L-1Tris-CL：稱取Tris-Base 6.057 g溶于超純水80mL中，用濃鹽酸調整pH至6.8，定容至100mL。10%APS：稱取過硫酸銨2.282 g溶于超純水8 mL中，定容至10mL。Running Buffer：稱取 Tris-Base 3.03 g， Glycine 18.8 g， SDS 5 g溶解，定容至1 000mL。1×SDS上樣緩沖液： 0.05mol·L-1Tris-HCL，100mM β-巰基乙醇，2%（m/V）SDS，0.1%（m/V）溴酚藍，10%（V/V）甘油。染色液：0.1%（m/V）考馬斯亮藍R-250，25%（V/V）甘油，10%（V/V）冰醋酸。脫色液：10%（V/V）醋酸，5%（V/V）乙醇量取醋酸100mL、乙醇50mL溶于超純水800mL中，定容至1 000mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗準備及樣品處理

用自來水清洗燒杯、電泳儀及其配件，蒸餾水沖洗干凈，晾干備用，玻璃板先用自來水清洗，擦干，酒精棉球擦干，自然晾干備用。

1.3.2 配膠

15%分離膠和5%濃縮膠的配制方法見表1。

表1 尿素-SDS-PAGE法制膠配方

5%分離膠：在燒杯中依次加入超純水2.3mL、30%丙烯酰胺5 mL、1.5 mol·L-1Tris-CL 2.5 mL、10%SDS 0.1 mL、10%APS 0.1 mL、TEMED 0.004 mL，加入TEMED混合均勻后，立即用吸管加入膠板中（倒膠時，以梳子齒端為參照，預留1 cm濃縮膠空間），膠上加滿蒸餾水封閉，以防蒸發(fā)，分離膠室溫約30min即可完全凝固。5%濃縮膠：燒杯中依次加入合適量的超純水2.1mL、30%丙烯酰胺0.5 mL、0.5 mol·L-1Tris-CL 0.38 mL、10%SDS 0.03 mL、10%APS 0.03mL，先將分離膠上的超純水倒掉，并用濾紙小心吸干殘留水分，再將TEMED 0.003mL加入燒杯中，混合均勻立即用移液槍滴加到分離膠上，插入合適的梳子，積層膠約20min可完全凝固。

1.3.3 加樣

小心拔掉梳子，組裝好電泳儀。然后倒入1×Running Buffer。將蛋白Marker和處理好的樣品按順序加入膠孔，并做好記錄。

1.3.4 跑膠

加樣完畢即可跑膠，可固定電壓進行跑膠。Bio-Rad電泳儀可固定在200V，君意電泳儀固定在150V，當染帶剛剛跑出膠板時，跑膠完成。

1.3.5 卸膠

小心拆卸膠板，用分離器小心將兩層玻璃板分離，切去積層膠。

1.3.6 染色

將分離膠放于染色盒中，倒入染色液20mL，放在搖床上慢慢搖動。染色20min即可。

1.3.7 脫色

將分離膠取出，放于脫色盒，倒入脫色液30 mL，放在搖床上慢慢搖動過夜，或隨時觀察，直至分離膠除有蛋白的地方為藍色其余部分變?yōu)闊o色即可。

1.3.8 小分子多肽樣品中蛋白遷移率的測定及其相對分子質量的計算

用倍率計讀出照片上各樣品色帶中心與溴酚藍前沿的距離，按標記變化比率換算出實際尺寸進行計算。電泳遷移率為Rf，即樣品遷移距離與溴酚藍遷移距離的比值。以標準組多肽的遷移率為橫坐標，以其對應的相對分子質量對數(shù)為縱坐標繪制標準曲線。然后根據(jù)未知樣品的遷移率在曲線上查出其對應的相對分子質量。

2 結果與分析

2.1 小分子多肽樣品的尿素-SDS-PAGE結果

小分子多肽樣品的尿素-SDS-PAGE結果見圖1。

圖1 小分子多肽的尿素-SDS-PAGE蛋白電泳結果

由圖1可知，小分子蛋白樣品中蛋白濃度較高，SDS-PAGE電泳結果顯示，蛋白相對分子質量＜14.4 kD，樣品純度較高，無其他蛋白雜帶，陰性對照無特定條帶。

2.2 不同稀釋濃度小分子多肽樣品的尿素-SDSPAGE結果

不同稀釋濃度小分子多肽樣品的尿素-SDSPAGE結果見圖2。

圖2 小分子多肽樣品不同稀釋濃度的尿素-SDS-PAGE結果

通過10倍稀釋小分子多肽樣品，進行尿素-SDS-PAGE電泳，圖2顯示獲得了較好的結果，A1～A5小分子蛋白樣品濃度逐漸降低，呈現(xiàn)較好的規(guī)律變化。

2.3 尿素-SDS-PAGE中蛋白條帶遷移率及分子量標準曲線的繪制

尿素-SDS-PAGE中蛋白條帶遷移率及相對分子質量標準曲線的繪制見表2。

表2 尿素-SDS-PAGE中蛋白條帶遷移率的測定

由表2中的數(shù)據(jù)繪制完成可進行測定小分子蛋白相對分子質量的標準曲線，見圖3，其中相關系數(shù)R2＞0.99，表明建立的標準曲線可以用來測定小分子多肽的相對分子質量。

圖3 標準曲線

2.4 小分子多肽樣品中蛋白遷移率的測定及其相對分子質量的計算

測定尿素-SDS-PAGE電泳中小分子多肽樣品的遷移率為23.5，將此數(shù)值帶入到相對分子質量測定標準曲線方程中，計算得到待測小分子多肽樣品的相對分子質量為9.212 977 277 kD。

3 討論

隨著生物活性多肽物質的發(fā)現(xiàn)和多肽類藥物的研制，小分子多肽電泳已成為生物活性物質純化分析過程中經常使用的快速鑒定方法。凝膠電泳操作簡單、分辨率高，廣泛應用于蛋白質相對分子質量的測定。蛋白質相對分子質量的測定通常采用非連續(xù)的SDS-PAGE緩沖系統(tǒng)，緩沖液采用Tris-HCl；而多肽相對分子質量的測定采用Tris-Tricine緩沖液，可使小相對分子質量多肽在濃縮膠中有效地濃縮，從而提高分辨率。SDSPAGE的有效分離范圍取決于聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度，其孔徑隨著雙丙烯酰胺與丙烯酰胺比值的增加而減小，相對分子質量＜10 000的小分子肽，即使用較高濃度的聚丙烯酰胺凝膠的SDSPAGE也不能完全分離。本研究建立的雙層膠尿素-SDS-PAGE測定小分子多肽相對分子質量的方法操作簡便，將常規(guī)的3層膠改為2層膠（分離膠和濃縮膠），濃縮膠與分離膠采用同一緩沖體系，簡化操作步驟，減少由于凝膠制備而引起的諸多影響電泳的因素；分辨率高，將3層膠改為2層膠后，分離膠的有效長度增加，可使單位凝膠長度下容納的電泳條帶數(shù)增加，從而使分辨率提高；成本低，替代了昂貴的Tris-Tricine緩沖系統(tǒng)，電極緩沖液可以重復利用；電泳時間短，由原來5～6 h縮短為2.5 h，達到了快速檢測的目的。

本試驗用含6mol·L-1尿素的SDS-PAGE方法，不需銀染而直接用考馬斯亮藍R2250染色1.5～2 h，即可把標準品中的條帶顯示清楚，且簡單方便，試驗范圍內多肽相對分子質量的對數(shù)與遷移率呈良好的線性關系，相關系數(shù)達到0.993 8。該方法的建立為小分子多肽分子量的估算提供了一種較好方法。

[1]鄒毅,祝沛平,趙曉麗,等.用一種改進的電泳方法測定抗凍蛋白的分子量[J].生物技術,1999,9（4）:37-40.

[2]楊聯(lián)萍,孔祥平,易學瑞.SDS-PAGE電泳對小分子多肽的分析[J].生物工程進展,1998,18（6）:48-50.

[3]張曉楠,張延鳳,曹云新,等.尿素-SDS-PAGE快速測定多肽的相對分子質量[J].細胞與分子免疫學雜志,2001,17（1）:87-97.

[4]石繼紅,趙永同,王俊樓,等.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析小分子多肽[J].第四軍醫(yī)大學學報,2000,21（6）:761-763.

[5]馮來坤,黃超美,楊洪群,等.轉移因子口服給藥國內外研究進展[J].中國生化藥物雜志,1999,20（5）:265-267.