王福軍，蔡軍，劉巖，顧松，張希濤，安向光，顏均，高杰，蘇丕雄

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬朝陽醫(yī)院，北京 100020)

miRNA是一類存在于真核生物中內(nèi)源性非編碼小分子RNA，參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控;它通過與靶基因序列的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)以堿基互補(bǔ)配對的方式來執(zhí)行對靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯抑制功能，從而調(diào)控基因的表達(dá)［1］。miRNA-17～92家族與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)［2］，能促進(jìn)肺臟細(xì)胞起源和心臟分隔作用的發(fā)生。整合素(ITG)是細(xì)胞表面的異二聚體受體，包含α和β兩種亞型，它們通過與細(xì)胞外基質(zhì)配體結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器發(fā)生變化，最終引起病理生理變化。ITG表達(dá)與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有著緊密關(guān)系［3］，ITG的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致心律失常和心肌收縮功能障礙［4］。有文獻(xiàn)指出，ITG受體β8(ITG-β8)和配體蛋白4.1B結(jié)合共同調(diào)控胚胎心臟的發(fā)育［5］。但是，有關(guān)ITG-β8與心血管疾病的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。2011年3月～2012年12月，我們就miRNA-17與ITG-β8的調(diào)控抑制關(guān)系進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 ①主要試劑:HEK293T細(xì)胞，Ultrapure Agarose(GIBCOTM美國);1 ×TAE:0.040 mol/L Tris-Acetate和0.001 mol/L EDTA，pH 7.5;DNA 電泳用6 ×loading buffer:40%Ficoll，0.06%溴酚蘭，培養(yǎng)液(GIBCOTMnvitrogen，美國)，胎牛血清(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所);消化液:含有0.25%胰蛋白酶的0.02%的 EDTA，無血清培養(yǎng)基(GIBCOTMInvitrogen，美國)，LipofectamineTM2000 Reagent(Invitrogen公司，美國)，引物合成(華大基因，北京)，RNAsin(Promega，美國);細(xì)胞裂解液:25 mmol/L Tris-HCl、pH 7.5，150 mmol/L NaCl，0.5%NP-40，0.5 mmol/L PMSF，0.5%protease inhibitor cocktail。②主要儀器:水浴恒溫箱(DK-8)(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，水平電泳槽(北京市六一儀器廠)，超凈工作臺(tái)(BCM-8)(蘇州凈化設(shè)備公司)，電熱恒溫孵育箱(DNP-9082)、干燥消毒烤箱(DHG-9246A)(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，紫外分光光度計(jì)(美國Bio-tek儀器公司)，臺(tái)式離心機(jī)、低溫高速離心機(jī)(5417C)(德國Eppendorf公司)，搖床(TS-1)(海門市其林貝爾儀器公司)，CO2孵箱(Thermo Forma美國)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad iQ5美國)，凝膠成像系統(tǒng)(UVP美國)，F(xiàn)-4500 fluorescence spectrophotometer(HITACHI日本)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取HEK293T細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMIDMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，2～3 d換液，待細(xì)胞融合70%～80%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 靶基因載體的構(gòu)建 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件Target Scan、Miranda和 PicTar對 miRNA-17進(jìn)行靶基因預(yù)測。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白cDNA用限制性內(nèi)切酶消化并亞克隆成pcDNA3.1，用人腦的cDNA數(shù)據(jù)庫克隆成含有miRNA-17預(yù)測靶點(diǎn)的ITG-β8的3'UTR，即 pcDNA3.1/EGFP，進(jìn)一步應(yīng)用 BamHI、EcoRI設(shè)計(jì)成合適的核苷酸長度。

1.2.3 miRNA-17的真核表達(dá)載體的構(gòu)建 生物學(xué)軟件預(yù)測靶基因序列和已知miRNA-17基因序列見圖1、圖2。目的片段經(jīng)過T-A克隆后篩選正確的序列，將其亞克隆到pcDNA3.1(+)上，然后進(jìn)行酶切鑒定和測序分析其正確性。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miRNA-17轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞 ，然后采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測成熟miRNA-17的表達(dá)水平。

圖1 生物學(xué)軟件預(yù)測靶基因序列

圖2 已知miRNA-17基因序列

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與反義寡核苷酸技術(shù) 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2，每2～3 d用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化，以2×105/mL接種至6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞長至培養(yǎng)板70%融合時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為二組，即 ITG-β8+miRNA-17組和 ITG-β8+pcDNA3.1組。為了進(jìn)一步證實(shí)miRNA-17調(diào)節(jié)抑制ITG-β8的特性，我們又設(shè)計(jì)合成miRNA-17的反義寡核苷酸序列(ITG-β8+ASO-miRNA-17)組和無義寡核苷酸序列(ITG-β8+ASO-Ctl)組，按照上述基因構(gòu)建方法分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h，裂解細(xì)胞并提取蛋白。然后利用F-4500 fluorescence spectrophotometer檢測各組綠色熒光蛋白的光密度值作為綠色熒光蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，先對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用方差分析及t檢驗(yàn)。P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

綠色熒光蛋白表達(dá)水平:ITG-β8組為12.03±0.02，ITG-β8+miRNA-17 組為 9.33 ±0.04，ITG-β8+pcDNA3.1 組 為 11.04 ±0.09，ITG-β8+ASO-miR-17 組為 13.76 ±0.07，ITG-β8+ASO-Ctl組為11.34 ±0.09。ITG-β8+miRNA-17 組綠色熒光蛋白表達(dá)水平較ITG-β8+pcDNA3.1組明顯下降(P＜0.05)，ITG-β8+ASO-miR-17 組綠色熒光蛋白水平與 ITG-β8+pcDNA3.1 組、ITG-β8+ASO-Ctl組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＞0.05)。見圖3。雙熒光素酶報(bào)告基因分析提示，miRNR-17能夠特異結(jié)合基因的ITG-β83'UTR區(qū)域使靶基因的mRNA表達(dá)量下降。HEK293T細(xì)胞未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染miRNA-17、轉(zhuǎn)染ASO-miNA-17綠色熒光蛋白染色見圖4。

圖3 各組綠色熒光蛋白表達(dá)水平比較

圖4 HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后綠色熒光蛋白染色

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與多種心血管疾病的發(fā)病過程，如心肌肥厚、心衰［6，7］、心律失常、心肌細(xì)胞凋亡等［8］。miRNA一般通過與靶基因miRNA 3'UTR的相互作用來調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，尤其是miRNA5'端種子序列與靶基因的匹配程度尤為重要。我們通過網(wǎng)站預(yù)測到了miRNA-17可能的靶基因ITG-β8。BLAST數(shù)據(jù)庫比對表明，ITG-β8的3'UTR區(qū)確實(shí)存在與miRNA-17的5'端相互作用的序列。在熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)miR-17能降低ITG-β83'UTR報(bào)告質(zhì)粒的綠色熒光蛋白的表達(dá)水平，但對于ITG-β83'UTR報(bào)告空質(zhì)粒pcDNA3.1-Egfp-ITG-β88-3'UTR 表達(dá)綠色熒光蛋白卻沒有明顯影響。說明miRNA-17能夠作用于ITG-β83'UTR的特異性序列，是miRNA-17的靶基因。利用反義寡核苷酸技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)，通過無義序列抑制miRNA-17的方法，可使綠色熒光蛋白恢復(fù)原來水平。

ITG是由α和β亞基通過非共價(jià)鍵組成的異二聚體，是細(xì)胞表面一類重要的兼具黏附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的受體。α亞單位與配體結(jié)合發(fā)揮作用，而β亞單位主要介導(dǎo)黏附、連接、信號傳導(dǎo)等功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)，β亞單位的胞質(zhì)尾通過蛋白質(zhì)之間的相互連接起到信號傳導(dǎo)的樞紐作用［9，10］。ITG是心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用的主要部分，在心臟發(fā)育過程中，ITG的模式表達(dá)變化表明細(xì)胞外基質(zhì)與特定的ITG之間有協(xié)同表達(dá)的特點(diǎn)，不同亞單位組合形成的ITG在心肌發(fā)育和疾病等生理病理過程中發(fā)揮不同的作用。

本研究結(jié)果證明，ITG-β8是miR-17的靶基因，反義核酸技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)miRNA-17可以負(fù)性調(diào)控靶基因ITG-β8的表達(dá)。利用反義寡核苷酸技術(shù)開展針對miR-17的靶向治療，將可能減少先天性心臟病的發(fā)生。但是，ITG-β8影響心血管疾病的具體機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究闡明。

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