汪建峰，蒙海林，熊智強，王勇

1中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所 合成生物學(xué)重點實驗室，上海 200032

2華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237

天然產(chǎn)物一直都是臨床藥物開發(fā)的重要源泉。近十年來基因組、宏基因組測序工作的大規(guī)模開展以及新的高效篩選方法的引入，讓人們重新認識到自然界中存在著遠遠超出預(yù)期的天然產(chǎn)物或與其合成相關(guān)的基因資源，合成生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)更是讓天然產(chǎn)物的研究獲得了全新的機遇[1-2]。合成生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)深深地影響了天然產(chǎn)物研究的各個環(huán)節(jié)，天然產(chǎn)物從初期的篩選，到后續(xù)的開發(fā)、生產(chǎn)和制造正在發(fā)生一場深刻的變革。通過挖掘天然產(chǎn)物合成相關(guān)的生物學(xué)元件，經(jīng)理性設(shè)計并在底盤細胞中集成裝配，進一步結(jié)合人工生物系統(tǒng)中各功能模塊的優(yōu)化與適配后，可有效地進行珍稀天然產(chǎn)物高效合成[3]。植物源抗瘧疾藥物青蒿素的中間體青蒿酸的微生物合成即是這一領(lǐng)域最成功的典范。Keasling及其合作者經(jīng)過十多年的努力，陸續(xù)完成了青蒿酸合成途徑基因的分離，在釀酒酵母細胞中對青蒿酸合成途徑進行重新設(shè)計、集成裝配、模塊適配等工作，最終使釀酒酵母合成了超過25 g/L的青蒿酸[4]。該工作成功地利用微生物發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)植物來源的青蒿酸，實現(xiàn)全天候廉價地生產(chǎn)珍稀天然藥物。傳統(tǒng)天然產(chǎn)物及生物學(xué)的研究已經(jīng)為天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究提供了大量的生物學(xué)素材，但隨著研究的深入，亟需開發(fā)更多的生物元件，并對現(xiàn)有的生物元件庫進行更新升級和標準化，為構(gòu)建相關(guān)的細胞工廠實現(xiàn)珍稀化合物的大量合成或獲得更多的新穎化合物打下基礎(chǔ)。此外，隨著人工合成系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜度的增加，也需要進一步發(fā)展新的理論和方法，更科學(xué)地進行生物元件到功能模塊與系統(tǒng)的組裝適配[5]。本文將以天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究為背景，從生物元件的人工設(shè)計，生物元件的挖掘，由生物元件到功能模塊系統(tǒng)的組裝適配來闡述該領(lǐng)域的研究思路與方法。

1 合成生物學(xué)元件的人工理性設(shè)計

生物元件 (Biological parts)是具有特定功能的氨基酸或核苷酸序列，如用于基因表達調(diào)控的調(diào)控元件 (包括啟動子、終止子、核糖體結(jié)合位點 (RBS))，特定功能的結(jié)構(gòu)元件 (如天然產(chǎn)物合成途徑中酶基因)等。它們是生物體最基本的組成單元，也是合成生物學(xué)研究中構(gòu)建人工生命體最基礎(chǔ)的磚塊[6]。不同來源不同功能的生物元件，可以通過復(fù)雜的設(shè)計，與其他元件或模塊組裝成更大規(guī)模的具有特定生物學(xué)功能的生物回路、裝置和系統(tǒng)。因此，生物元件的挖掘與開發(fā)是設(shè)計與組裝更高層次的功能模塊和生命系統(tǒng)的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究積累大量的DNA和蛋白質(zhì)元件，并對許多元件進行了定義?？蒲腥藛T將這些生物元件整理歸檔到了一系列開放的元件庫中，如美國麻省理工大學(xué)的標準生物元件登記庫 (Registry of Standard Biological Parts，http://partsregistry.org)，Keasling教授課題組開發(fā)的The Joint BioEnergy Institute Inventory of Composable Elements(JBEI-ICEs)[7]等。這些元件庫的建立大大促進了元件的標準化，方便了其在合成生物學(xué)方面的應(yīng)用。但是相對于浩瀚的天然生物資源，已開發(fā)的資源還是極其有限的，僅以微生物資源為例，可培養(yǎng)的微生物僅僅占微生物資源總量的1%，這些未開發(fā)的生物資源中蘊藏著大量功能新穎的生物元件[8]。此外更精細復(fù)雜的合成生物學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計，對生物元件的功能及生物特性等提出了更高品質(zhì)的要求。因此設(shè)計與開發(fā)更高品質(zhì)的非天然元件，挖掘更多特性新穎的天然元件，是豐富生物元件庫的兩大策略，也是合成生物學(xué)發(fā)展最原始的驅(qū)動力。根據(jù)設(shè)計策略的差別主要有兩種方法：一是基于隨機突變與文庫篩選的方法，二是基于模型計算和預(yù)測的理性設(shè)計方法。

雖然通過構(gòu)建文庫的方法來設(shè)計符合預(yù)期特性的啟動子或RBS等調(diào)控元件是一種非常有效的方法，但大規(guī)模人工生命系統(tǒng)的構(gòu)建往往涉及數(shù)目龐大的調(diào)控元件，而文庫的構(gòu)建與元件的篩選效率低下。此外許多蛋白質(zhì)元件 (如酶蛋白，調(diào)控蛋白等)缺少高通量模型，無法快速地進行文庫篩選以獲得預(yù)期功能的突變體。因此根據(jù)掌握的元件序列與功能之間存在的特殊關(guān)系，建立計算機模型對元件的關(guān)鍵位點進行改造，理性設(shè)計具有預(yù)期功能和控制特性的元件是元件設(shè)計的重要方向。

De May等[9]利用偏最小二乘 (PLS)回歸法建立了大腸桿菌組成型啟動子序列與強度關(guān)系的預(yù)測模型，但預(yù)測準確度有待提高。在模型預(yù)測的指導(dǎo)下可合理地選擇最適強度的啟動子并結(jié)合啟動子敲入 (Knock-in)技術(shù)去調(diào)控代謝途徑上基因的表達，從而實現(xiàn)途徑的優(yōu)化[10]。Rhodius等[11]以大腸桿菌中σE因子識別和結(jié)合的啟動子為代表，提出了一種基于位置權(quán)重矩陣(PWM)模型的強度預(yù)測方法。他們把60個σE啟動子的?35～+20區(qū)域劃分為?35、?10、spacer等功能模體，并對每個功能模體進行PWM打分，然后對PWM得分總和與強度值的對數(shù)進行線性化擬合，發(fā)現(xiàn)部分模體的聯(lián)合得分與啟動子強度具有較好的相關(guān)性，R值普遍在0.57至0.77之間。而在RBS設(shè)計方面，Salis等[12]通過將描述翻譯起始的生物物理模型與最優(yōu)化算法相結(jié)合，提出了一套熱力學(xué)預(yù)測模型用于RBS的設(shè)計。它通過預(yù)測RBS與核糖體結(jié)合的強度，可對蛋白翻譯的起始速率及蛋白表達水平進行定量調(diào)控。該模型的擬合相關(guān)系數(shù)較高 (|R|最高達到0.9)。

以上的研究雖然在啟動子或RBS強度預(yù)測方面已取得了一些進展，但完全基于強度預(yù)測的理性設(shè)計仍然是十分困難的，主要是由于已有模型預(yù)測準確度偏低，難以從真正意義上實現(xiàn)啟動子或RBS的序列設(shè)計，而且缺乏通用性。實際上，由于序列與強度之間存在十分復(fù)雜的非線性對應(yīng)關(guān)系，而現(xiàn)有模型普遍采用線性回歸分析方法或經(jīng)過簡單數(shù)據(jù)處理 (比如取對數(shù))后的回歸分析方法難以反映這些復(fù)雜的內(nèi)在關(guān)系，從而導(dǎo)致預(yù)測準確率偏低。為解決這一難題，本實驗室采用了非線性映射能力很強的建模方法——人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (Artificial neural network，ANN)來反映這些非線性關(guān)系[13]，如圖1所示，建立了預(yù)測效果更佳、普適性更好的預(yù)測模型和方法，這些模型和方法可用于指導(dǎo)合成生物學(xué)精細調(diào)控元件的理性設(shè)計。

以原核Trc啟動子&RBS調(diào)控元件為例，首先基于易錯PCR技術(shù)及熒光定量篩選法構(gòu)建了其突變文庫 (包含100個序列，相對強度值介于0～3.56之間)。將文庫數(shù)據(jù)隨機分為訓(xùn)練集 (不超過90個數(shù)據(jù))和測試集 (不少于10個數(shù)據(jù))兩個集合，用Matlab建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，并用訓(xùn)練集數(shù)據(jù)進行訓(xùn)練。模型對測試集數(shù)據(jù)的預(yù)測誤差隨著訓(xùn)練集規(guī)模的增加而減小，當訓(xùn)練集達到90個數(shù)據(jù)時，模型的總體預(yù)測性能達到最佳。在經(jīng)過神經(jīng)元個數(shù)、網(wǎng)絡(luò)層數(shù)、訓(xùn)練參數(shù)等多種參數(shù)綜合優(yōu)化之后，在已構(gòu)建的1 326 000個模型中，獲得了5個預(yù)測性能非常好的模型，這些模型解決了BP網(wǎng)絡(luò)在訓(xùn)練中容易出現(xiàn)的過擬合問題，使模型對測試集數(shù)據(jù)的預(yù)測結(jié)果非常接近于實驗測量結(jié)果。圖1給出了最優(yōu)模型(NET90_19_576)的訓(xùn)練和預(yù)測 (測試)結(jié)果，其訓(xùn)練和預(yù)測的擬合相關(guān)系數(shù) (R值)都達到了0.98，遠遠超過PWM等方法 (圖1B)，表明人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型很好地反映了元件序列和強度之間復(fù)雜的非線性關(guān)系。

圖1 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)理性設(shè)計Trc啟動子&RBS調(diào)控元件[13](A：調(diào)控元件構(gòu)建的流程圖。B：對Trc啟動子&RBS元件進行PWM打分后的最佳擬合結(jié)果。C：采用ANN方法進行對訓(xùn)練集數(shù)據(jù)的預(yù)測結(jié)果與測量結(jié)果之間的擬合。D：采用ANN方法進行對測試集數(shù)據(jù)的預(yù)測結(jié)果與測量結(jié)果之間的擬合。E：人工設(shè)計元件的預(yù)期值與實驗測量值)Fig.1 Rational design of Trc promoter&RBS regulatory element using artificial neural network[13].(A)The workflow of regulatory element library construction.(B)The best fitting results of log Trc promoter&RBS activities with their PWM scores.(C)The predicted relative strengths of promoter&RBS fit with the measured values using the data of training set.(D)The predicted values fit with the measured values using the data of test set.(E)The desired and measured strength of artificially designed elements.

以模型NET90_19_576為基礎(chǔ)，進一步對野生型序列的每個堿基進行單位點突變，由模型預(yù)測相應(yīng)的強度值，考察每個位點對強度值的影響，從而得到“關(guān)鍵位點”及“非關(guān)鍵位點”。隨后基于“關(guān)鍵位點”的組合突變設(shè)計Matlab程序，用NET90_19_576模型實現(xiàn)了全新序列的從頭設(shè)計。用所設(shè)計的元件序列，成功地實現(xiàn)了小肽BmK1在大腸桿菌中有效表達和萜類化合物合成途徑的精細定量調(diào)控。這不僅有效地解決了小肽蛋白的高效表達及代謝網(wǎng)絡(luò)的精確調(diào)控等問題，也證明了通過人工理性設(shè)計的方法所獲得的調(diào)控序列是可行的、可靠的。該結(jié)果表明了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法在精細調(diào)控元件理性設(shè)計上的應(yīng)用價值，以及人工設(shè)計元件在合成生物學(xué)中的巨大應(yīng)用潛力。

2 天然產(chǎn)物合成相關(guān)元件的挖掘、集成與裝配

某一特定代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)的一組基因，在底盤細胞中重新設(shè)計、組裝和集成，就能利用底盤細胞已有的代謝網(wǎng)絡(luò)合成目標產(chǎn)物，實現(xiàn)天然產(chǎn)物的異源高效合成。根據(jù)合成途徑和構(gòu)建單元的模塊化特性，目前研究人員已經(jīng)在不同的微生物宿主中 (如大腸桿菌Escherichia coli，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，橙黃色粘球菌Myxococcus xanthus)[1,14]成功地構(gòu)建了萜類(單萜，倍半萜，二萜等)[15]，聚酮類 (Erythromycin A，Epothilone D 等)[16]，苯丙烷酸類 (Resveratrol，Narigenin等)[17]，生物堿類化合物[18]的異源合成模塊，如表1所示。挖掘和利用已有的生物元件，理性地設(shè)計和組裝更高效的異源途徑是途徑重構(gòu)的努力目標。

2.1 前體合成模塊的改造

如何重構(gòu)底盤細胞，尤其是其前體合成模塊，強化前體供應(yīng)是構(gòu)建高效底盤細胞的一個重要方面。目前，研究人員重點從前體合成直接相關(guān)的途徑入手，通過特性元件的替換和表達強度的精細調(diào)控，打破途徑存在的代謝瓶頸與負調(diào)控[19-20]。大量的研究表明引入下游合成模塊以后，宿主內(nèi)源的代謝往往無法為其提供足夠的前體和輔因子。如大腸桿菌本身不能合成萜類化合物，僅能由2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸 (MEP)途徑合成少量的異戊烯基焦磷酸/二甲基烯丙基焦磷酸 (IPP/DMAPP)前體，用于某些必需的細胞結(jié)構(gòu)成分的合成。因此當萜類合成的下游模塊引入到野生型大腸桿菌以后，往往只能合成非常微量的目的產(chǎn)物[39]。

甲羥戊酸 (MVA)途徑和MEP途徑是天然存在的兩條萜類化合物前體IPP/DMAPP合成途徑。兩個模塊以不同碳單位 (MVA途徑以乙酰-CoA為單位，MEP途徑以三磷酸甘油醛和丙酮酸為單位)起始，在合成途徑和反應(yīng)上表現(xiàn)出完全不同的動力學(xué)和熱力學(xué)特性。Keasling等[38]創(chuàng)造性地將酵母MVA途徑模塊完全引入E.coli中，構(gòu)建了同時擁有MVA途徑和MEP途徑兩前體合成模塊的工程菌株，大大提高了菌株的萜類合成能力。后續(xù)的改造發(fā)現(xiàn)用來自糞鏈球菌EnterococcusfaecalisMVA途徑模塊的HMG-CoA合成酶基因，HMG-CoA還原酶基因代替酵母模塊相應(yīng)的基因后，可以進一步提高異戊烯的合成[40]。這些研究表明不同菌株來源的元件和模塊是工程菌株前體合成模塊改造的重要資源，通過這些元件和模塊的裝配能夠顯著增強底盤細胞前體的供應(yīng)。雖然外源MVA途徑和內(nèi)源MEP途徑模塊同時存在的方式，能夠顯著提高萜類的合成能力，但是我們通過全基因組模型的分析，發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中MEP途徑比MVA途徑具有更大的代謝潛力[41]。隨著許多以MEP途徑為萜類前體供應(yīng)途徑并含有豐富萜類次級代謝的微生物的陸續(xù)報道，MEP途徑元件和模塊的數(shù)據(jù)也越來越多，而且不同來源的元件表現(xiàn)出完全不同的催化和調(diào)控特性。本研究組選取了鏈霉菌、芽胞桿菌、糖多胞菌、歐文氏菌等不同菌屬為代表，系統(tǒng)地挖掘了相關(guān)的dxs、ispD、ispF、idi等MEP途徑基因元件 (圖2)。結(jié)果表明阿維鏈霉菌來源的dxs2基因，大腸桿菌來源的ispF基因，紅霉糖多胞菌來源的ispD基因，枯草芽胞桿菌和阿維來源的idi基因能夠明顯地強化大腸桿菌MEP途徑的代謝通量，增加萜類化合物Amorphadiene和Lycopene的合成。隨后我們以過表達阿維鏈霉菌dxs2基因的工程菌作為出發(fā)菌株，通過逐次疊加共表達大腸桿菌ispF基因，紅霉糖多胞菌ispD基因，枯草芽胞桿菌idi基因，阿維鏈霉菌idi基因，獲得了共表達阿維鏈霉菌dxs2和枯草芽胞桿菌idi基因的工程菌，分別使Amorphadiene和Lycopene的產(chǎn)量相對于原始菌株增加了15.5倍和16.5倍。對MEP途徑的轉(zhuǎn)錄水平進行分析發(fā)現(xiàn)，共表達阿維鏈霉菌dxs2和枯草芽胞桿菌idi基因菌株的內(nèi)源MEP途徑基因的轉(zhuǎn)入水平獲得了明顯地強化。這些研究結(jié)果表明表達某些來源的MEP途徑基因不僅能夠強化途徑中關(guān)鍵步驟的活性，同時也能夠激活大腸桿菌內(nèi)源MEP途徑基因的表達，從而有效地解除MEP途徑的代謝瓶頸。

表1 重要天然產(chǎn)物的異源合成Table 1 Heterologous biosynthesis of important natural products

2.2 下游合成模塊的設(shè)計與裝配

隨著基因組學(xué)研究的深入，越來越多的化合物生物合成途徑及其相關(guān)基因被陸續(xù)闡明。從這些研究結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)某一個特定化合物的合成途徑往往存在于來自不同種屬的生物體中，如胡蘿卜素類化合物的合成途徑廣泛分布于植物、細菌、真菌中[42]。同一化合物不同種屬來源的途徑也表現(xiàn)出明顯的差異性，如Lycopene合成途徑的八氫番茄紅素脫氫酶[43]。此外，同一家族的許多化合物具有相似的母核，共有部分代謝途徑。所有這些大自然賦予的生物合成途徑多樣性和相似性都可以被用于某個化合物異源合成模塊的設(shè)計和裝配。據(jù)報道甜葉菊Steviarebaudiana中的甜菊糖和二萜化合物赤霉素的合成途徑均以貝殼烯酸作為共有中間代謝物，因此產(chǎn)赤霉素的植物和微生物中與貝殼烯酸合成相關(guān)的基因是甜菊糖異源合成途徑構(gòu)建的重要資源[44-45]。本研究組系統(tǒng)地挖掘了數(shù)據(jù)庫中與貝殼烯及終產(chǎn)物甜菊糖類化合物合成相關(guān)的基因資源，在E.coli中重構(gòu)了異源合成途徑，實現(xiàn)了由微生物從頭合成萊鮑迪苷A(圖2)。與所有萜類化合物一樣，甜葉菊中萊鮑迪苷A的合成是以IPP和DMAPP為前體，經(jīng)GGPPS，古巴焦磷酸合酶 (CDPS)，貝殼烯合酶 (KS)催化后形成貝殼烯，再經(jīng)兩個P450氧化酶貝殼烯氧化酶 (KO)和貝殼烯酸羥化酶 (KAH)作用形成二萜母核甜菊醇。甜菊醇經(jīng)四步糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)(UGT85C2，？，UGT74G1，UGT76G1)，最終合成萊鮑迪苷A。我們還以更具活性的加拿大紅豆杉GGPPS取代甜葉菊的GGPPS，利用小立碗蘚Physcomitrella patens的雙功能KS[46]取代甜葉菊的CDPS和KS重構(gòu)貝殼烯合成途徑，使貝殼烯的產(chǎn)量獲得了明顯提高。由于甜菊糖的合成途徑中，存在著一步未知的糖基轉(zhuǎn)移酶，因此基于甜葉菊來源的元件目前還無法構(gòu)建完成的瑞鮑迪苷A合成途徑。本課題組利用最大的碳水化合物活性酶 (Carbohydrate-ActiveenZymes，CAZymes)數(shù)據(jù)庫，從1 000多個糖基轉(zhuǎn)移酶中篩選出了真菌斯塔摩酵母Candida bombicola的UGTB1糖基轉(zhuǎn)移酶，可能具有催化甜菊糖合成第二步糖基轉(zhuǎn)移的活性[47]。于是將UGTB1與甜葉菊的KO/P450氧化還原蛋白 (CPR)，甜葉菊KAH、UGT85C2糖基轉(zhuǎn)移酶、UGT74G1糖基轉(zhuǎn)移酶、UGT76G1糖基轉(zhuǎn)移酶進一步組裝到了甜葉菊合成途徑中，最終實現(xiàn)了瑞鮑迪苷A的從頭合成。

圖2 萜類化合物高產(chǎn)菌株的構(gòu)建.Fig.2 Construction of high-yield isoprenoids producers.

在重構(gòu)紫杉醇途徑的過程中，受到植物來源的元件有限，而且往往受到物種親緣關(guān)系較遠的影響，在微生物宿主中表達與活性均不甚理想，需要經(jīng)過密碼子優(yōu)化及催化特性的改造?？紤]到產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌資源的多樣性，本課組以Ta x o l生物合成基因簇中紫杉二烯合酶(Taxadiene synthase，TS)、C-13苯丙氨酸側(cè)鏈輔酶A?；D(zhuǎn)移酶 (C-13 phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase，BAPT)和 10巴卡亭III?；D(zhuǎn)移酶 (10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase，DBAT)為靶向設(shè)計了同源引物，通過對紅豆杉來源的內(nèi)生真菌樣品進行保守序列PCR，從產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌中篩選出了新的TS、BAPT和DBAT功能元件[48]。經(jīng)簡單的序列分析發(fā)現(xiàn)這些真菌來源的元件與植物來源的相比，具有很低的同源性，可以為異源Taxol合成途徑的組裝提供更多元化選擇。

2.3 產(chǎn)物轉(zhuǎn)運模塊的裝配

圖3 產(chǎn)物轉(zhuǎn)運模塊的改造.Fig.3 Modification of the product transportation module.

在底盤細胞中通過重構(gòu)合成途徑，進行天然產(chǎn)物的異源合成，如何解決異源產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運，增加底盤細胞對產(chǎn)物的耐受性是一個關(guān)鍵問題，這也是提高工程菌株產(chǎn)物合成能力的重要手段。許多產(chǎn)生復(fù)雜次生代謝物的宿主具有多種天然的機制以確保產(chǎn)物可以運出胞外，并使訴諸本身對特定產(chǎn)物具有一定的耐受性，如廣泛存在的多藥耐藥泵系統(tǒng)、熱激蛋白的表達、細胞膜的修飾等機制。多藥外排泵系統(tǒng) (Multidrug Efflux Pump)是一類廣泛存在的能夠?qū)麅?nèi)的藥物或毒性物質(zhì)排除胞外的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，如大腸桿菌的三組分耐藥泵AcrAB-TolC系統(tǒng)，綠膿假單胞菌Pseudomonas aeruginosa中的MexAB-OprM系統(tǒng)等具有非常寬泛的底物特異性，可以將多種抗生素、有機溶劑、金屬離子轉(zhuǎn)運到細胞外[49]。在萜類化合物的異源合成研究中，本課題組以大腸桿菌的三組分耐藥泵作為改造對象 (圖3)，通過逐個強化大腸桿菌內(nèi)源AcrAB-TolC各組分的表達，發(fā)現(xiàn)外膜通道蛋白TolC及外排轉(zhuǎn)運蛋白AcrB的過表達能夠顯著提高萜類化合物Amorphadiene和貝殼烯的合成[50]?？紤]到三組分耐藥泵是一個以AcrA：AcrB：TolC=3:6:3精細裝配的分子機器，我們對3個組分進行兩兩組合強化表達，同時進行各組分比例的精細調(diào)控。最終組合TolC&TolC&AcrB使Amorphadiene的比產(chǎn)率提高了118%，而AcrA&TolC&AcrB使貝殼烯的比產(chǎn)率提高了104%。這些結(jié)果說明強化工程菌株的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)確實能夠有效地提高目標產(chǎn)物的合成。三組分耐藥泵作為最主要的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，針對其的改造具有非常重要的意義。除大腸桿菌內(nèi)源的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，許多耐藥菌也存在著類似的系統(tǒng)。于是我們在大腸桿菌中過表達了來自綠膿假單胞菌的MexAB-OprM轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，當單獨表達外排轉(zhuǎn)運蛋白MexB時，Amorphadiene和貝殼烯的比產(chǎn)率提高了70%，比單獨表達TolC或AcrB取得了更明顯的效果。此外我們也嘗試異源轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的組合表達及異源內(nèi)源組分的共表達，相比于前述AcrAB-TolC組分的組合表達，目標產(chǎn)物產(chǎn)率沒有能夠取得更進一步的提高，但是異源耐藥泵仍舊是轉(zhuǎn)運系統(tǒng)重構(gòu)的重要元件。

3 合成生物學(xué)系統(tǒng)的優(yōu)化與適配

異源合成模塊的導(dǎo)入使原有宿主系統(tǒng)獲得合成某種目標產(chǎn)物的能力，但其生產(chǎn)效率及產(chǎn)率通常仍處于較低水平，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。這是由于異源合成模塊與原有宿主系統(tǒng)之間尚存在不適配問題。因此，從整體上對宿主系統(tǒng)進行優(yōu)化并改善其與異源合成模塊之間的互作與適配，是大幅提高下游目標產(chǎn)物合成效率的重要研究內(nèi)容。

3.1 異源合成系統(tǒng)的優(yōu)化與設(shè)計

盡管經(jīng)典的誘變育種及代謝工程策略已成功應(yīng)用于優(yōu)化宿主系統(tǒng)和提高產(chǎn)率，但誘變育種具有很大的隨機性，給定向篩選帶來很大的困難，費時費力；代謝工程則對多基因決定的性狀難以達到理想效果[51]，而且難以發(fā)現(xiàn)與目標產(chǎn)物代謝不直接相關(guān)的關(guān)鍵靶點。近年來，基因組尺度代謝模型 (GSMM)的提出[52]使菌種改造研究提升到系統(tǒng)的高度?；贕SMM，采用通量平衡分析 (FBA)[53]、最小代謝調(diào)整分析 (MOMA)[54]等in silico分析方法，可發(fā)現(xiàn)某些影響目標產(chǎn)物合成的關(guān)鍵基因靶點，尤其是與產(chǎn)物合成不密切相關(guān)的靶點。通過計算機輔助的理性分析設(shè)計，可以有效減少實驗的盲目性，提高工作效率并降低實驗成本。為此，本實驗室在FBA、MOMA等經(jīng)典算法的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計了兩套算法(FDCA和LMOMA-Based)[55]，并用于預(yù)測一些可能提高目標產(chǎn)物產(chǎn)率的關(guān)鍵基因改造靶點(圖 4)。

圖4 基于FDCA及LMOMA算法的異源合成系統(tǒng)設(shè)計與優(yōu)化Fig.4 Heterologous biosynthetic system design and optimization based on FDCA and LMOMA algorithm.

我們以大腸桿菌為宿主、葡萄糖為底物、紅霉素中間體6dEB作目標產(chǎn)物為例，通過FDCA和LMOMA-Based算法獲得了一些潛在基因敲除位點[55]，為提高6dEB異源合成產(chǎn)率奠定了理論基礎(chǔ)。

3.2 元件與模塊的適配

基于GSMM的整體代謝優(yōu)化可改善宿主的網(wǎng)絡(luò)流量分布，使代謝流量盡可能多地流向目標產(chǎn)物的合成。然而，異源合成模塊與宿主系統(tǒng)之間并非是完美協(xié)作的，各元件之間、下游與前體模塊之間如何實現(xiàn)合理的搭配，消除元件、模塊之間因不適配而引起中間代謝物積累與能量的消耗，也是增強目的產(chǎn)物合成的重要手段。這是因為細胞生命活動是時間和空間上都是多層次交互作用 (DNA復(fù)制，基因轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)翻譯，物質(zhì)與能量代謝，代謝物的運輸與分泌，細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等)的結(jié)果，僅僅基于不同模塊代謝網(wǎng)絡(luò)之間代謝流量的分析，進行生物模塊之間的簡單改造是無法實現(xiàn)系統(tǒng)的最佳適配。Kim等[56]通過研究大腸桿菌中一條與磷酸吡哆醛合成相關(guān)的新代謝途徑與細胞已知代謝網(wǎng)絡(luò)之間的相互作用發(fā)現(xiàn)：當新的或外源途徑引入到已有的細胞網(wǎng)絡(luò)后，存在著多個層次的相互作用：1)新代謝產(chǎn)物與已有代謝網(wǎng)絡(luò)的干擾；2)已有代謝產(chǎn)物與新代謝網(wǎng)絡(luò)的干擾；3)新代謝途徑中酶的某些非特異性活性，造成某些中間代謝物和能量因子被消耗，同時新代謝產(chǎn)物對細胞已有調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的干擾等。異源系統(tǒng)中由于各種來源，不同特性的元件、模塊之間的不適配必然會存在類似的負相互作用，因此元件、模塊適配和重組系統(tǒng)調(diào)試是異源合成研究的新熱點。

本實驗室在in silico代謝網(wǎng)絡(luò)分析及優(yōu)化的基礎(chǔ)上，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組芯片分析及基于13C標記的代謝流量分析，可從不同層次上對異源合成模塊與宿主系統(tǒng)間的互作及適配機制進行探討。例如，通過對6dEB在大腸桿菌中的異源合成進行不同層次的考察，發(fā)現(xiàn)不同功能模塊之間在真實情形下與“理想情形”下 (細胞完全以產(chǎn)物合成為目標)存在較大的表型差異，包括轉(zhuǎn)錄水平及代謝水平上的整體差異，反映了不同模塊間確實存在適配性問題，并直接影響了目標產(chǎn)物的合成效率。因此，通過對模塊內(nèi)與模塊間的相關(guān)基因進行改造，縮小真實情形與“理想情形”的差異，改善模塊間的適配性問題，是提高目標產(chǎn)物異源合成效率的關(guān)鍵所在，也是本實驗室正在開展的工作。

4 展望

隨著研究材料的豐富和理論方法與技術(shù)的不斷完善進步，合成生物學(xué)技術(shù)將徹底變革傳統(tǒng)天然產(chǎn)物開發(fā)的研究思路，并最終實現(xiàn)珍稀天然產(chǎn)物的大規(guī)模制造和新化合物的發(fā)現(xiàn)。更多新天然元件的挖掘?qū)⑦M一步拓展人類認知與合成生物學(xué)應(yīng)用的范圍，豐富新合成生物學(xué)系統(tǒng)構(gòu)建的生物磚，同時運用新的元件也能夠改進已有系統(tǒng)的效率，發(fā)揮系統(tǒng)優(yōu)化的作用。新的元件裝配和系統(tǒng)適配思路與方法的實施，也大大提升人工生命系統(tǒng)的性能與品質(zhì)。集成運用以上方法后，異源產(chǎn)物的合成效率獲得了顯著的提升，許多珍貴的化合物產(chǎn)量由初始的毫克/升水平增加到了克/升，甚至幾十克/升。部分產(chǎn)品的工藝 (如青蒿酸)即將取代了原有的生產(chǎn)方式，正在進行中試和工業(yè)規(guī)模的放大研究。因此從生物元件挖掘設(shè)計到模塊系統(tǒng)的組裝適配各方面的思路，方法與技術(shù)的革新，將全面促進合成生物學(xué)技術(shù)發(fā)展與成熟。

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