陳駿毅，周全博，張岷，陳煒，羅蒙

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院普外科，上海 200127)

門靜脈高壓癥(portal hypertension，PHT)是由門靜脈壓力病理性升高所產(chǎn)生的綜合征，主要由肝硬化所引起。形成PHT的因素中，肝內(nèi)血管阻力增加是始動(dòng)因素，而內(nèi)臟及全身高血流動(dòng)力循環(huán)是阻力增加的結(jié)果，也是維持PHT的繼發(fā)因素。產(chǎn)生和維持高血流動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)的重要因素是持續(xù)的肝外血管擴(kuò)張，而內(nèi)臟動(dòng)脈血管的擴(kuò)張作用尤為明顯［1-2］。在不同的PHT動(dòng)物模型中都有內(nèi)臟血管擴(kuò)張以及血流量增加的現(xiàn)象，從而引起門靜脈的血流量增加［3］。目前已知，PHT時(shí)內(nèi)臟血管擴(kuò)張與血管擴(kuò)張因子增多相關(guān)，其中一氧化氮(nitric oxide，NO)是最具代表性的血管擴(kuò)張因子之一。動(dòng)脈產(chǎn)生過多NO在PHT血管功能異常中具有重要作用。眾多研究已經(jīng)證實(shí)，PHT中過多產(chǎn)生的NO主要是由于內(nèi)皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活化增加所引起［4-5］。

鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)是一種穩(wěn)定的鈣結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白，它參與調(diào)控各種生命進(jìn)程，包括代謝、炎癥反應(yīng)以及血管的收縮與舒張等，是第一個(gè)被證實(shí)的可以調(diào)節(jié)eNOS的蛋白。它能夠激活eNOS，從而促進(jìn)NO的生物合成［6］。作為eNOS的調(diào)節(jié)蛋白，CaM是否參與了PHT內(nèi)臟血管的擴(kuò)張反應(yīng)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。本研究通過觀察四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝硬化PHT大鼠門靜脈血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及腸系膜動(dòng)脈內(nèi)CaM的表達(dá)變化，并比較CaM特異性抑制劑W-7干預(yù)前后PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)的反應(yīng)性，探討CaM在CCl4誘導(dǎo)肝硬化PHT內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)中的作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇雄性SD大鼠80只，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重(220±30)g。飼養(yǎng)條件:SPF級(jí)動(dòng)物房，恒溫恒濕，光照和黑暗各12 h交替，自由飲水和進(jìn)食顆粒飼料。隨機(jī)分為PHT組(n=60)和對(duì)照組(n=20)，60只SD大鼠制備PHT模型。

1.2 模型制備

將配制好的60%的CCl4油溶液(CCl4∶植物油=3∶2)以 0.05 ml·kg－1作背部皮下注射，共 14 周，每周2次，同時(shí)間斷飲用5%乙醇，制備PHT模型。對(duì)照組以同樣的方式和劑量予生理鹽水(NS)皮下注射，正常飲食飲水。

1.3 主要儀器、抗體及試劑

微血管灌流槽由美國(guó)紐約醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室友情贊助;超聲探測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)百盛公司MYLAB，探頭型號(hào)為L(zhǎng)A523;解剖顯微鏡和光學(xué)顯微鏡均購(gòu)自日本Olympus公司;兔抗鼠CaM抗體由美國(guó)AbCaM公司提供;p-eNOS抗體由美國(guó)Cell Signaling Technology(CST)公司提供;W-7由美國(guó)Sigma公司提供;MOPS緩沖液由上海利韜生物科技有限公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)肝硬化門靜脈壓力＞12 mmHg且肝臟有明顯結(jié)節(jié)的大鼠納入PHT組。PHT模型制備成功后將大鼠分成兩部分，一部分(8只)與對(duì)照組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，剩余的PHT組大鼠再隨機(jī)分為(1)PHT+W-7組(n=26):W-7溶于 NS配成50 μmol·L－1的溶液，從第 12 周開始，于背部注射CCl4的同時(shí)按5 mg·kg－1體重腹腔注射，每周2次，連續(xù)注射2周;(2)PHT+NS組(n=26):同樣的劑量和方式用NS腹腔注射。

1.4.1 門靜脈流量的測(cè)定 測(cè)定前24 h大鼠禁食、不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉成功后，備皮、固定，超聲探測(cè)儀測(cè)量門靜脈流量。

1.4.2 門靜脈壓力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［7］的方法操作，測(cè)定前24 h大鼠禁食、不禁水。第14周造模完成之后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后正中切口進(jìn)腹，分離門靜脈主干，將連接穿刺針的導(dǎo)管內(nèi)充滿NS，將穿刺針插入門靜脈主干并固定，導(dǎo)管端與換能器連接，通過多功能檢測(cè)儀直接讀取門靜脈壓力值(將零點(diǎn)設(shè)在第一腰椎上方1 cm處，即門靜脈起始部水平)。

1.4.3 標(biāo)本的獲取 切取大鼠的全部系膜及小腸，立即置入0～4℃、pH=7.4的MOPS緩沖液中。剪取一段近端小腸及系膜保留備用，其余部分在解剖顯微鏡下分離并抽取腸系膜上動(dòng)脈及其主要分支，置于－80℃保存。

1.4.4 血管灌流系統(tǒng)的建立和腸系膜微動(dòng)脈對(duì)NE反應(yīng)性的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［8］的方法操作。在解剖顯微鏡下，顯微解剖器械銳性分離保留的腸系膜三級(jí)微動(dòng)脈(直徑約100 ～150 μm，長(zhǎng)約2 ～3 mm)，并迅速轉(zhuǎn)移到血管灌流槽。并將此微動(dòng)脈的近端套在灌流槽入口的玻璃微管上，11-0結(jié)扎線固定，加20 mmHg壓力沖去管腔內(nèi)血液，另一端套在出口的玻璃微管上，同樣方式固定(分離、轉(zhuǎn)移和固定過程中務(wù)必不能損傷血管)。將血管灌流槽與蠕動(dòng)泵連接，構(gòu)成循環(huán)流動(dòng)的系統(tǒng)。通過水浴鍋的加溫作用使循環(huán)溫度控制在37℃。入口的玻璃微管與壓力控制器相連，管腔緩慢加壓，達(dá)到并維持在80 mmHg。顯微鏡攝像系統(tǒng)與顯示器連接，通過VMR v1.02(一種測(cè)量軟件)系統(tǒng)可直接測(cè)量血管內(nèi)徑。獲取三級(jí)微動(dòng)脈并在此環(huán)境中穩(wěn)定30 min，按累積濃度法(10－8～10－5mol·L－1)向循環(huán)系統(tǒng)中加入NE，同時(shí)記錄不同NE濃度下的血管內(nèi)徑，內(nèi)經(jīng)改變量(μm)占最大血管內(nèi)徑(μm)的百分比即為收縮率。以血管收縮率為縱坐標(biāo)，NE濃度的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制NE的量-效曲線圖，對(duì)比不同分組量-效曲線間的差異以及當(dāng)收縮率達(dá)到50%時(shí)NE的濃度(即EC50值)。

1.4.5 腸系膜動(dòng)脈內(nèi)CaM和p-eNOS蛋白表達(dá)的測(cè)定 采用Western-bloting方法分別檢測(cè)各組腸系膜動(dòng)脈內(nèi) CaM和 p-eNOS的蛋白表達(dá)，以 β-actin為內(nèi)參照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組門靜脈流量

門靜脈流量 PHT 組為(1.874 5 ±0.156 54)ml·min－1，明顯低于對(duì)照組［(2.631 7 ± 0.143 98)ml·min－1］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。PHT組大鼠注射 W-7 后，門靜脈流量為(1.915 9 ±0.141 43)ml·min－1;在注射 NS后門靜脈流量為(1.867 8±0.086 05)ml·min－1。分別與 PHT 組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，圖1)。

圖1 各組大鼠門靜脈流量的變化Fig 1 Changes of portal vein blood flow in rats of each group

2.2 門靜脈壓力的變化

門靜脈壓力對(duì)照組為(7.43 ±0.66)mmHg，PHT組為(15.15±0.78)mmHg，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PHT組注射 W-7后，門靜脈壓力為(14.95±1.24)mmHg;注射 NS 后，門靜脈壓力為(14.786 ±1.16)mmHg，分別與 PHT 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠門靜脈壓力的變化Fig 2 Changes of portal vein pressure in rats of each group

2.3 腸系膜微動(dòng)脈對(duì)NE的反應(yīng)性

與對(duì)照組相比，PHT組大鼠腸系膜微動(dòng)脈的NE量-效曲線明顯右移，EC50也明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PHT組經(jīng)W-7處理后，NE量-效曲線明顯左移，EC50值也明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而經(jīng)NS處理前后，PHT大鼠的NE量-效曲線無明顯變化，EC50值也無明顯差異(圖3、4)。

圖3 各組大鼠腸系膜微動(dòng)脈的NE量-效曲線圖Fig 3 The dose-response curves of mesenteric microcirculation artery to NE in rats of each group

2.4 各組腸系膜動(dòng)脈內(nèi)CaM和p-eNOS蛋白表達(dá)的

Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，PHT組腸系膜動(dòng)脈內(nèi)CaM和p-eNOS的蛋白表達(dá)比對(duì)照組明顯上調(diào)，經(jīng)W-7干預(yù)之后，與PHT組相比，大鼠p-eNOS的蛋白表達(dá)明顯降低，但NS干預(yù)后大鼠p-eNOS的蛋白表達(dá)與PHT組無明顯變化(圖5)。

圖4 各組大鼠的EC50值，F(xiàn)ig 4 EC50values of rats in each group

圖5 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)CaM和p-eNOS的蛋白電泳條帶圖Fig 5 Protein electrophoretic bands of CaM and p-eNOS in mesenteric artery in rats of each group

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比正常大鼠與CCl4誘導(dǎo)的肝硬化PHT大鼠的門靜脈血流情況及肝內(nèi)阻力情況，證實(shí)了肝硬化PHT大鼠確實(shí)存在門靜脈血流量減少及肝內(nèi)阻力增加的現(xiàn)象;通過測(cè)定大鼠離體腸系膜微動(dòng)脈對(duì)NE的反應(yīng)性變化還證實(shí)了肝硬化PHT內(nèi)臟動(dòng)脈血管對(duì)縮血管物質(zhì)反應(yīng)性降低。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都與之前對(duì)門靜脈結(jié)扎所致的門靜脈高壓大鼠的研究結(jié)論相一致［9］。

國(guó)內(nèi)、外報(bào)道的其他的PHT動(dòng)物模型中檢測(cè)到的CaM和p-eNOS表達(dá)是升高的［10-11］。我們對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝硬化PHT大鼠進(jìn)行檢測(cè)，也得了相同的結(jié)論。PHT組經(jīng)CaM特異性抑制劑W-7處理后，大鼠內(nèi)臟動(dòng)脈內(nèi)p-eNOS表達(dá)明顯降低。我們還發(fā)現(xiàn)，W-7可以增加肝硬化PHT大鼠腸系膜微血管對(duì)NE的反應(yīng)性，這些均說明過表達(dá)的CaM可能通過促進(jìn)eNOS活化為p-eNOS，引起NO合成增加，參與PHT大鼠內(nèi)臟動(dòng)脈低反應(yīng)性的形成。W-7通過抑制eNOS的活化來增強(qiáng)腸系膜微動(dòng)脈對(duì)NE的反應(yīng)性，但又未能將其完全逆轉(zhuǎn)，說明還有其他的因素參與了PHT內(nèi)臟血管變化和高動(dòng)力循環(huán)的形成，這些結(jié)果都與Gadano等［11］研究相一致。PHT組大鼠的門靜脈壓力較對(duì)照組明顯升高，說明CCl4誘導(dǎo)肝硬化PHT存在肝內(nèi)阻力增加，進(jìn)而引起門靜脈流量的減少。但是W-7既不能改善門靜脈血流，也不能降低門靜脈壓力。我們認(rèn)為門靜脈血流動(dòng)力學(xué)的變化及門靜脈壓力的調(diào)節(jié)都是受多因素調(diào)控的，僅僅通過W-7來阻斷CaM信號(hào)通路可能并不足以影響門靜脈血流及門靜脈壓力，而且眾所周知，肝硬化PHT時(shí)肝內(nèi)、肝外的許多現(xiàn)象是矛盾的，PHT肝外血管擴(kuò)張的同時(shí)，肝內(nèi)血管卻是收縮的，CaM信號(hào)通路的阻斷可能會(huì)增加肝內(nèi)血管的阻力，從而抵消改善肝外血管功能所帶來的益處［12］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過比較正常組大鼠和肝硬化PHT大鼠的內(nèi)臟動(dòng)脈內(nèi)的CaM和p-eNOS的表達(dá)變化、腸系膜微動(dòng)脈對(duì)NE的反應(yīng)性變化，以及W-7能抑制eNOS的活化并改善肝硬化PHT大鼠內(nèi)臟動(dòng)脈對(duì)縮血管物質(zhì)低反應(yīng)性，證實(shí)了肝硬化PHT中過度生成的CaM通過增強(qiáng)eNOS的活化，增加NO的合成，降低內(nèi)臟動(dòng)脈對(duì)縮血管物質(zhì)的反應(yīng)性，進(jìn)而引起內(nèi)臟動(dòng)脈擴(kuò)張，參與高動(dòng)力循環(huán)的形成，為臨床肝硬化PHT相關(guān)并發(fā)癥的治療提供了新的思路。

［1］IWAKIRI Y.The Molecules mechanisms of arterial vasodilatation observed in the splanchnic and systemic circulation in portal hypertension［J］.J Clin Gastroenterol，2007，41，Suppl，3:288-294.

［2］COLLE I，GEERTS A M，Van STEENKISTE C，et al.Hemodynamic changes in splanchnic blood vessels in portal hypertension［J］.Anat Rec(Hoboken)，2008，291(6):699-713.

［3］ HENNENBERG M，TREBICKA J，SAUERBRUCH T，et al.Mechanisms of extrahepatic vasodilation in portal hypertension［J］.Gut，2008，57(9):1300-1314.

［4］MARTELL M，COLL M，EZKURDIA N，et al.Physiopathology of splanchnic vasodilation in portal hypertension［J］.World J Hepatol，2010，2(6):208-220.

［5］KIM M Y，BAIK S K.Hyperdynamic circulation in patients with liver cirrhosis and portal hypertension［J］.Korean J Gastroenterol，2009，54(3):143-148.

［6］PIAZZA M，F(xiàn)UTREGA K，SPRATT D E，et al.Structure and dynamics of calmodulin(CaM)bound to nitric oxide synthase peptides:effects of a phosphomimetic CaM mutation［J］.Biochemistry，2012，51(17):3651-3661.

［7］CAO H，XU J，HUA R，et al.Expression of cyclooxygenase in hyperdynamic portal hypertensive rats［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2006，5(2):252-256.

［8］SUN D，MESSINA EJ，KALEY G，et al.Characteristics and origin of myogenic response in isolated mesenteric arterioles［J］.Am J Physiol，1992，263(5 Pt 2):H1486-1491.

［9］AI J H，YANG Z，QIU F Z，et al.Heat shock protein 90 is responsible for hyperdynamic circulation in portal hypertensive rats［J］.World J Gastroenterol，2003，9(11):2544-2547.

［10］THEODORAKIS N G，WANG Y N，WU J M，et al.Role of endothelial nitric oxide synthase in the development of portal hypertension in the carbon tetrachloride-induced liver fibrosis model［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.2009，297(4):G792-799.

［11］GADANO A C，SOGNI P，YANG S，et al.Endothelial calcium-calmodulin dependent nitric oxide synthase in the in vitro vascular hyporeactivity of portal hypertensive rats［J］.J Hepatol，1997，26(3):678-686.

［12］SHAH V，CAO S，HENDRICKSON H，et al.Regulation of hepatic eNOS by caveolin and calmodulin after bile duct ligation in rats［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001，280(6):G1209-1216.