劉大麗 ，馬龍彪 ，郝 慧

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗室，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱 150080）

甜菜是我國主要的糖料作物之一，其含糖率及產(chǎn)量直接關(guān)系到糖料的生產(chǎn)和發(fā)展[1]。常規(guī)的育種方法在提高產(chǎn)量和含糖率上逐漸表現(xiàn)出來了很大的局限性。隨著生物技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程技術(shù)為解決這一難題提供了有效而便捷的方法。

蔗糖是植物體內(nèi)光合同化物由葉到果實(shí)的主要運(yùn)輸形式，也是決定甜菜品質(zhì)形成的關(guān)鍵因子[2－3]。高等植物的蔗糖代謝是一個復(fù)雜的過程，其中，蔗糖磷酸合成酶（Suerosephosphate synthase，EC2.3.1.14，SPS）與蔗糖的代謝密切相關(guān)。SPS是一種可溶性酶，存在于細(xì)胞質(zhì)中，催化如下可逆反應(yīng)：UDPG+6-磷酸果糖?6-磷酸蔗糖+UDP。許多果實(shí)成熟過程中蔗糖積累與SPS活性的升高密切相關(guān)[4－5]。因此，克隆甜菜BvSPS基因，并進(jìn)而將其轉(zhuǎn)化到甜菜植株中去，能夠有效地提高甜菜塊根的含糖率及品質(zhì)，進(jìn)而有效地促進(jìn)我國甜菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料及試劑

實(shí)驗所用的甜菜試管苗、植物表達(dá)載體pBI121、農(nóng)桿菌菌株EHA105由黑龍江大學(xué)甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗室提供。T4 ligase （Biolabs）；Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞（Transgen）；Taq DNA polymerase（Transgen）；限制性內(nèi)切酶（MBI）；未特殊注明試劑均為進(jìn)口分析純。

1.2 pBI121-BvSPS植物表達(dá)載體的構(gòu)建

分別將順式插入甜菜 BvSPS（Genbank accession no.X81975）基因的 pMD 18-T-BvSPS載體[6]、pBI121載體用PstI、SacI限制性內(nèi)切酶酶切，Tris飽和酚提純后用Klenow大片段補(bǔ)平，再經(jīng)過Tris飽和酚提純后用XbaI限制性內(nèi)切酶酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收BvSPS片段及pBI121片段；將目的片段BvSPS和載體pBI121按照3∶1的摩爾比建立連接反應(yīng)體系，16°C連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過Kana抗性篩選出待測陽性克?。淮郎y克隆經(jīng)過質(zhì)粒提取及PCR鑒定，引物參見[6]，進(jìn)一步確定重組子pBI121-BvSPS。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，待用。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜菜遺傳轉(zhuǎn)化

以甜菜無菌苗的葉柄為轉(zhuǎn)基因的外植體，將其置于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6-BA）中2 d；分別用濃度為OD600=0.4、0.6、0.8的含有pBI121-BvSPS的農(nóng)桿菌侵染甜菜葉柄外植體，侵染時間為5 min、10 min、15 min，然后置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6-BA+100 μmol/L AS）中暗培養(yǎng) 2 d、4 d、6 d；最后，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6-BA+200 mg/L Kana）中進(jìn)行抗性芽的分化和篩選。

1.4 甜菜基因組DNA的提取及轉(zhuǎn)基因甜菜的分子鑒定

利用CTAB法提取甜菜基因組DNA。根據(jù)甜菜BvSPS基因及pBI121的序列信息，利用Primer premier 5.0設(shè)計鑒定引物：上游引物（5'-3'）為 GAC CTG CAG GCA TGC AAG CTT；下游引物（5'-3'）為 CCT GAC GTG GAT TGG AGT TAT，擴(kuò)增片段長度約為680 bp，引物由上海生工合成。

取 100 ng 甜菜基因組 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94°C，4 min；94°C（30s）；62°C（45s）；72°C（1 min），39個循環(huán)；72°C延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并利用GenSnap 6.08（f）進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體pBI121-BvSPS的構(gòu)建

實(shí)驗分別利用pBI121、pMD 18-T-BvSPS進(jìn)行酶切以獲得連接所需的載體及目的片段。如圖1所示，通過質(zhì)粒提取及特異引物的PCR鑒定，pBI121-BvSPS重組質(zhì)粒被成功地構(gòu)建并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。該重組的植物雙元表達(dá)載體被用于甜菜轉(zhuǎn)基因的研究。

2.2 甜菜BvSPS轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化

植物基因遺傳轉(zhuǎn)化過程錯綜復(fù)雜，其中各種轉(zhuǎn)化因子直接關(guān)系到基因的轉(zhuǎn)化效率。本研究著重從農(nóng)桿菌的侵染濃度、侵染時間及共培養(yǎng)時間方面對甜菜轉(zhuǎn)基因體系進(jìn)行了優(yōu)化。如表1所示，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染濃度OD600值為0.6，侵染時間5 min，共培養(yǎng)4 d后，甜菜葉柄外植體經(jīng)過侵染后，其不定芽比率最高，約為36.6%、33.3%及38.3%。而侵染濃度和時間過高或過長，都會由于農(nóng)桿菌生長頻率較快而導(dǎo)致甜菜葉柄死亡。

依據(jù)以上實(shí)驗結(jié)果，確定最適農(nóng)桿菌濃度是OD600值為0.6，最適侵染時間為5 min，最佳共培養(yǎng)時間為4 d。

2.3 BvSPS轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

剪取野生型及待測轉(zhuǎn)基因甜菜新鮮葉片，利用CTAB法提取甜菜基因組DNA，以提取的DNA為模板進(jìn)行Kana抗性苗PCR擴(kuò)增檢測。

如圖2所示，陽性質(zhì)粒pBI121-BvSPS對照的擴(kuò)增條帶最亮，野生型陰性對照沒有明顯擴(kuò)增出特異性條帶。而待測8株轉(zhuǎn)基因植株則分別不同程度地擴(kuò)增出了和陽性對照同等大小的目的條帶，這就證明BvSPS基因被不同程度地轉(zhuǎn)化并整合到甜菜基因組中。

圖1 pBI121-BvSPS植物表達(dá)載體的PCR鑒定

表1 甜菜轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化

圖2 轉(zhuǎn)基因甜菜的PCR檢測

3 討論

隨著甜菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及人民生活水平的提高，傳統(tǒng)的遺傳改良方式已經(jīng)無法滿足人們對糖制品的需求。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高甜菜含糖率成為最為快速有效的方法之一。甜菜基因工程在我國起步較晚，轉(zhuǎn)基因研究主要集中在甜菜的病害及抗除草劑方面[7－8]。本研究則利用分化率較高的、遺傳性狀穩(wěn)定的和再生能力較強(qiáng)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，建立高效而穩(wěn)定的外源基因整合方法，并成功將BvSPS基因穩(wěn)定而高效地轉(zhuǎn)化到甜菜基因組內(nèi)。由于甜菜BvSPS基因存在于甜菜基因組內(nèi)，轉(zhuǎn)基因植株檢測過程中，用于分子鑒定的PCR引物特殊設(shè)計了上游引物位于pBI121載體上的堿基序列，下游引物位于BvSPS基因內(nèi)部，這就避免了檢測過程中假陽性的出現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因植株也將進(jìn)一步生根、栽培，所獲得的種子將進(jìn)一步用于篩選、比較研究及實(shí)際應(yīng)用。

[1]朱向明，韓秉進(jìn)，張秋英，等.黑土區(qū)甜菜新品種間塊根產(chǎn)量與含糖率差異[J].土壤與作物，2012，1（2）：126-128.

[2]Huber S C,Huber J L.Role of sucrose phosphate synthase in sucrose metabolism in leaves[J].Plant Physiol.,1992,99：1275-1278.

[3]Fiew S,Willenbrend J.Sucrose synthase and sucrose phosphate synthase in sugar beet plants（Beta vulgaris L.ssp.altisima）[J].J Plant Physiol,1987,131：153-162.

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[5]Cumino A,Curatti L,Giarrocco L,et al.Sucrose metabolism：Anabaena sucrose-phosphate synthase and sucrose-phosphate phosphatase define minmal functional domains shuffled during evolution[J].FEBS Lett,2002,517（1-3）：19-23.

[6]劉大麗，馬龍彪，郝慧.甜菜蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及序列分析[J].中國糖料，2010（4）：6-8.

[7]劉大麗，馬龍彪，王皙瑋，等.應(yīng)用 RT-PCR 技術(shù)檢測甜菜壞死黃脈病毒[J].中國糖料，2008（2）：12-17.

[8]孫亞卿，邵金旺，張少英.甜菜基因工程研究進(jìn)展及其展望[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（4）：27-32.