雷 靜，萬(wàn) 霖，李惠新

(蘭州大學(xué)1.第二臨床醫(yī)學(xué)院;2.第二醫(yī)院婦科，甘肅蘭州730000)

卵巢癌是臨床上死亡率最高、預(yù)后最差的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制與原癌基因的激活及抑癌基因的突變、缺失等密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)染色體13q11-q12區(qū)域的基因雜合性損傷及缺失與多種原發(fā)性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［1］。LATS2基因定位于13q11-q12，編碼絲/蘇氨基酸蛋白激酶，定位于中心體，主要負(fù)責(zé)積累γ-微管蛋白和紡錘體的形成，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［2－3］。隨著對(duì)LATS2基因的廣泛研究發(fā)現(xiàn)與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。目前關(guān)于LATS2基因與卵巢癌關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。上皮性卵巢癌是最常見的類型，為此我們收集上皮性卵巢癌組織，采用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化法檢測(cè)上皮性卵巢癌組織中LATS2基因的mRNA和蛋白的表達(dá)情況，分析其與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本及臨床資料

組織標(biāo)本均來(lái)自于蘭州大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科(漿液性囊腺癌13例，黏液性囊腺癌7例，漿液性囊腺瘤10例，正常卵巢組織10例)，并經(jīng)過(guò)患者及家屬的口頭知情同意。石蠟切片來(lái)源于蘭州大學(xué)第二醫(yī)院病理科，共110例(上皮性卵巢癌58例，漿、黏液性囊腺瘤共30例，正常組織22例)，所有患者均未接受放、化療，臨床病例資料完整。

1.2 主要試劑

RNAiso Plus、cDNA和SYBR Green PCR試劑等(TaKaRa公司)，引物(大連寶生物公司)，LATS2引物序列:上游:5'-GCTTCATCCACCGAGACATCAA-3'，下 游:5'-CGACAGTTAGACACATCATCCCAGA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為198 bp;內(nèi)參基因β-actin引物序列:上游:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游:5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為196 bp。兔抗人LATS2多克隆抗體(博奧森生物)，免疫組化所需試劑(北京中杉金橋公司)。

1.3 RT-PCR

按試劑盒說(shuō)明操作，反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL RT-PCR產(chǎn)物于2.5%瓊脂凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描。

1.4 SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR

按Two Step RNA PCR試劑盒說(shuō)明操作，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s及60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán);95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。采用 2－△△Ct法對(duì)LATS2基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.5 免疫組化

按試劑盒說(shuō)明書操作。LATS2蛋白陽(yáng)性染色定位于胞質(zhì)，DAB染色后出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用雙盲法隨機(jī)選擇10個(gè)具有代表意義的高倍視野(×200)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞取平均數(shù)作為本病例的最終的結(jié)果。以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例分為:10%(－)，11% ～29%(+)，30% ～50%(++)，＞50%(+++);染色強(qiáng)度判定:不著色(－)，淺棕黃色(+)，棕黃色(++)，棕褐色(+++)，根據(jù)4個(gè)等級(jí)得出LATS2表達(dá)的評(píng)分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析3組間的表達(dá)差異;兩兩比較采用秩和檢驗(yàn);LATS2與臨床病理特征間的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LATS2 mRNA的表達(dá)

惡性組、良性組及正常卵巢組織中均有LATS2表達(dá)，并確定為目的條帶(圖1);SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR顯示 LATS2的熔解曲線為單一峰型，LATS2擴(kuò)增曲線基本平行(圖2)。LATS2在卵巢癌中的表達(dá)量為正常卵巢組織中的0.084倍(P＜0.001)、良性卵巢腫瘤的 0.208倍(P＜0.01)(表1)。

圖1 LATS2及其內(nèi)參在不同卵巢癌組織中的表達(dá)情況Fig 1 The expression of LATS2 mRNA in different ovarian cancer

表1 不同組卵巢組織中LATS2的表達(dá)Table 1 Expression of LATS2 mRNAin different ovarian tissue

圖2 LATS2產(chǎn)物的溶解曲線Fig 2 Melting curves of LATS2

2.2 LATS2表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系

LATS2在上皮性卵巢癌中、高分化組的表達(dá)量高于低分化組(P＜0.05)，在Ⅰ、Ⅱ期的陽(yáng)性表達(dá)量高于Ⅲ、Ⅳ期上皮性卵巢癌組織(P＜0.01)，有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)(表2)。

表2 LATS2在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)與臨床及病理特征之間的關(guān)系Table 2 Relationship between the expression of LATS2 mRNAin epithelial ovarian cancer tissue and the clinicopathological characteristics

2.3 LATS2蛋白的表達(dá)

LATS2的特異性染色主要存在于上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，極少見于核內(nèi)(圖3，4，5)。惡性組、良性組及正常組中的LATS2的陽(yáng)性表達(dá)率存在明顯差異(P＜0.01)。惡性組的LATS2表達(dá)水平低于良性組(P＜0.01)和正常組(P＜0.001)(表3)。

圖5 LATS2在卵巢癌組織中的表達(dá)Fig 4 The express of LATS2 protein in ovarian cancer tissue(×200)

表3 不同組中LATS2的表達(dá)情況Table 3 Expression of LATS2 protein in different ovarian tissue

2.4 LATS2表達(dá)下調(diào)或缺失與臨床病理特征之間的關(guān)系

LATS2在上皮性卵巢癌中、高分化組的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于低分化組(P＜0.01)，在Ⅰ、Ⅱ期的陽(yáng)性表達(dá)率則顯著高于Ⅲ、Ⅳ期上皮性卵巢癌組織(P＜0.001)，有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.01)(表4)。

3 討論

本研究PCR結(jié)果顯示LATS2在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)量均低于良性組和正常組，這與其他腫瘤中的表達(dá)情況類似。LATS2在乳腺癌組織中明顯低于正常組織，同時(shí)在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中的LATS2 mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)，且與其啟動(dòng)子高甲基化有關(guān)［4－5］。同樣在急性淋巴細(xì)胞白血病中也發(fā)現(xiàn)LATS2 mRNA低表達(dá)與啟動(dòng)子高甲基化有關(guān)，并與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，提示LATS2低表達(dá)可能與其啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)［6－7］。在惡性間皮瘤、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中也檢測(cè)到LATS2表達(dá)下調(diào)［8－9］。此外，免疫組化結(jié)果顯示LATS2在正常卵巢組織均為陽(yáng)性表達(dá)，而在上皮性卵巢癌中存在的表達(dá)缺失，達(dá)(25/58)43.1%，提示LATS2的缺失有可能成為鑒別正常卵巢和上皮性卵巢癌的標(biāo)記，為卵巢癌的早期診斷提供依據(jù)。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LATS2蛋白的表達(dá)主要位于胞質(zhì)，此結(jié)果與來(lái)自鼻咽癌的研究并不一致，LATS2在鼻咽癌組織中為高表達(dá)，LATS2高表達(dá)的鼻咽癌患者預(yù)后差，且LATS2主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞核［10］。這可能是因?yàn)楸茄拾┮环N與EBV感染有關(guān)的特殊頭頸部惡性腫瘤，而具體的病因目前尚無(wú)統(tǒng)一定論，有待進(jìn)一步深入研究。二者結(jié)果的不同提示LATS2在腫瘤發(fā)生中的作用具有組織特異性。

表4 LATS2在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)與臨床及病理特征之間的關(guān)系Table 4 Relationship between the expression of LATS2 protein in epithelial ovarian cancer tissue and the clinicopathological characteristics

結(jié)合臨床病理資料，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示LATS2基因的表達(dá)與年齡及病理類型無(wú)關(guān)。而上皮性卵巢癌的惡性程度越高，LATS2的表達(dá)量越低，提示了LATS2的高表達(dá)可以作為一種預(yù)后佳的標(biāo)志。進(jìn)一步分析LATS2的表達(dá)水平與卵巢癌患者的臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LATS2的低表達(dá)水平與卵巢癌的病理分期、分化級(jí)別及轉(zhuǎn)移等情況也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。提示LATS2可能會(huì)參與抑制卵巢癌進(jìn)一步惡化及轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能發(fā)生在LATS2基因序列的上游調(diào)節(jié)或其轉(zhuǎn)錄水平。

總之，本研究對(duì)LATS2的mRNA和蛋白表達(dá)水平與卵巢癌的關(guān)系做了初步研究，證實(shí)了LATS2的表達(dá)水平與卵巢癌的發(fā)生、惡性程度等呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。并為卵巢癌病情發(fā)展的預(yù)測(cè)的提供了分子水平的理論依據(jù)。

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