苑曉晨，李炳蔚，武清斌，荊瀛黎，盛有明，李宏偉，劉淑英，修瑞娟

(中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院微循環(huán)研究所，北京100005)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)的治療是世界性難題，探討其發(fā)展機制具有重要意義。微循環(huán)起著維持組織細胞正常功能活動的作用，可以將其作為研究 SCI的切入點［1－2］。采用激光多普勒技術、氫電極技術等方法觀察脊髓微循環(huán)得出的相對數值只能間接地反映微循環(huán)的變化，直觀性不夠。而國內報道的脊髓窗技術僅能對血管的管徑進行測量，無法觀測紅細胞(red blood cell，RBC)的流動和白細胞的黏附。此外，這些方法剝離了硬脊膜，需要通過不斷的進行人工腦脊液的恒溫灌流來維持脊髓的腦脊液平衡，為觀察脊髓損傷的慢性病變帶來不便。

本實驗擬通過熒光標記示蹤法來觀察脊髓軟脊膜血管內RBC的運動和白細胞的黏附滾動，實現對脊髓窗內微循環(huán)的有效觀測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑:丙烯酸樹脂(3M公司)，α-氰基丙烯酸正丁酯生物膠(康派特公司)，1，1'-Dioctadecyl-3，3，3'，3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate(Dil)和Rhodamine 6G(Sigma公司)。Dil工作液的配制與貯存:0.5 mg Dil溶于1 mL無水乙醇，室溫避光保存。將3 mg Rhodamine 6G溶于10 mL 0.9%氯化鈉注射液中，4℃避光保存。

1.1.2 實驗動物:本研究涉及的動物實驗經中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院微循環(huán)研究所倫理委員會審核、批準。SD大鼠［北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK(京)2011-0011］，8周齡雄性，清潔級，體質量250±10 g。

1.2 方法

1.2.1 動物麻醉:腹腔注射10%水合氯醛，0.3 mL/100 g，5～10 min后動物進入麻醉狀態(tài)。將動物置于恒溫電熱板上進行操作。

1.2.2 脊髓窗模型的制作:在參考相關文獻的基礎上進行改進［3］。暴露T9至T11胸椎的椎板。用半凝固的丙烯酸樹脂涂抹在大鼠T9和T11的棘突上，形成一個球狀物，便于椎體固定器的夾持。在T10椎板上開窗，暴露脊髓但不破壞硬脊膜。磨鉆打磨開窗邊緣及T9和T11椎板表面，以外徑為4.5 mm的塑料管為模具，將半凝固的丙烯酸樹脂涂抹在模具和骨窗周圍，待其快凝固時將塑料管拔出，丙烯酸樹脂可形成一個井型空間。將丙烯酸樹脂窗的上表面打磨平整后涂抹生物膠，黏接蓋玻片，封閉脊髓窗(圖1)。

1.2.3 RBC的分離和熒光標記:參考相關文獻［4－5］步驟如下:眼眶取血500 μL，肝素抗凝，4℃，2 000×g離心5 min。吸棄上層血清和中層的白細胞。用林格氏液洗滌離心，獲得洗滌后的RBC。取100 μL壓積 RBC置于10 mL林格氏液中，向林格氏液中加入100 μL的Dil工作液，避光室溫孵育30 min。孵育完成后反復洗滌并離心標記后的RBC，直至上清液中無Dil的紅色，即獲得可輸注的熒光標記紅細胞 (Dil-RBC)。最后向收集到的RBC中加入100 μL的林格氏液，充分混勻后備用。

1.2.4 大鼠脊髓窗內的熒光影像觀察:將大鼠置于動物活體熒光顯微系統(tǒng)下進行觀察 (圖2):大鼠微循環(huán)觀測椎體固定器將大鼠的T9和T11的棘突夾持固定，從而降低胸腔起伏造成的對焦干擾。觀測血流速度時，通過頸靜脈插管注射200 μL的Dil-RBC溶液，活體熒光顯微鏡下觀察 (綠色激發(fā)光);觀察白細胞黏附時，通過大鼠頸靜脈緩慢推注Rhodamine 6G工作液1 mL，綠色激發(fā)光源照射下觀察。Rhodamine 6G能夠標記白細胞 (多核粒細胞、淋巴細胞、單核/巨噬細胞)，而不會標記RBC［6－7］。

圖1 大鼠封閉脊髓窗結構示意圖Fig 1 Schematic illustration of the closed spinal window

2 結果

2.1 封閉式脊髓窗觀測

通過改進的封閉式脊髓窗，可以觀察到大鼠脊髓背側軟脊膜內的多根靜脈血管。呼吸造成的運動不會阻礙通過脊髓窗觀察血管形態(tài)、分布特點和血管密度;普通的落射光源下可以清晰的觀察血管網的分布、管徑和迂曲度等(圖3)。

2.2 RBC染色及觀測

體外觀察Dil孵育后的RBC，綠色激發(fā)光下可見RBC呈現橙紅色，細胞形態(tài)正常，沒有其他細胞碎片的存在(圖4)。通過綠色激發(fā)光可以清晰的觀察到RBC在血管內的運動軌跡(圖5)。采用細胞的匯聚和分散的方向來區(qū)分動脈和靜脈。細胞逐漸匯聚的為靜脈，細胞逐漸分散的為動脈。

2.3 白細胞染色及觀測

在靜脈注射羅丹明6G之后，持續(xù)觀察。10 min后可見白細胞在靜脈內壁上黏附滾動(圖6)。

3 討論

圖6 在靜脈上黏附的羅丹明6G標記的白細胞Fig 6 The Rhodamine 6G-labelled leukocytes adherent to vessels

SCI的病理損害分為原發(fā)性和繼發(fā)性。繼發(fā)性損傷的機制之一包括血管破壞和痙攣，血細胞的黏附及阻塞等［8］。相關結果多來自于免疫組織化學，活體監(jiān)測脊髓微循環(huán)的研究較少。目前監(jiān)測脊髓微循環(huán)有一定難度。脊髓被包繞在一個相對較為復雜的環(huán)境中(骨、脂肪、靜脈叢及腦脊液)。營養(yǎng)脊髓的各級血管管徑差異小，造影劑充盈效果較差，從而使核磁共振檢測技術不適合于用于脊髓的檢測［9］。

有學者曾經使用“封閉式脊髓窗”對大鼠脊髓軟脊膜進行微循環(huán)觀察［3］。但是使用普通的斜射光和垂直落射光，硬脊膜會將光線反射造成成像不清。此外，該方法僅能觀測血管管徑的變化，無法檢測血細胞的流動和黏附滾動等微循環(huán)狀態(tài)。如果將硬脊膜剝離，為了保證腦脊液壓力的穩(wěn)定，需要用人工腦脊液恒溫持續(xù)灌流。此種方法需要將灌流管、灌流泵和恒溫系統(tǒng)等設備與動物模型進行對接，比較適合于急性期的觀察，對于損傷后的長期的觀察不太適用。本實驗的優(yōu)點在于:維持硬脊膜的完整，不需要人工腦脊液的恒溫灌流，為慢性實驗觀察提供了條件。不破壞硬脊膜，也符合經典的Allen's打擊模型的制造標準［10］。此外，本實驗熒光標記體內的RBC和白細胞(多核粒細胞、淋巴細胞及單核/巨噬細胞)，使得觀測直觀準確，為探討血細胞在脊髓損傷中的變化提供了實驗基礎［11］。而使用專門的背側固定裝置，則可以減少呼吸運動對圖像的干擾。

綜上所述，通過改進的封閉式脊髓窗和微循環(huán)觀測椎體固定器，結合分子影像學手段，達到了對大鼠軟脊膜上微血管的形態(tài)特點、RBC運行狀態(tài)和白細胞的血管壁黏附滾動進行觀察和檢測的目的，為脊髓微血管研究提供實驗基礎。

［1］Sharma HS．Early microvascular reactions and blood-spinal cord barrier disruption are instrumental in pathophysiology of spinal cord injury and repair:novel therapeutic strategies including nanowired drug delivery to enhance neuroprotection［J］．J Neural Transm，2011，118:155－176．

［2］Fassbender JM，Whittemore SR，Hagg T．Targeting microvasculature for neuroprotection after SCI［J］．Neurotherapeutics，2011，8:240 －251．

［3］劉鵠，沈慧勇，唐勇，等．應用改進封閉脊髓窗技術活體觀察脊髓損傷后脊髓微循環(huán)變化［J］．中國脊柱脊髓雜志，2008，18:861－865．

［4］Cabrales P，Zanini GM，Meays D，et al．Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction，and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine［J］．Am J Pathol，2010，176:1306－1315．

［5］Unthank JL，Lash JM，Nixon JC，et al．Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements［J］．Microvasc Res，1993，45:193 －210．

［6］Dirnagl U，Niwa K，Sixt G，et al．Cortical hypoperfusion after global forebrain ischemia in rats is not caused by microvascular leukocyte plugging ［J］．Stroke，1994，25:1028－1038．

［7］Villringer A，Dirnagl U，Them A，et al．Imaging of leukocytes within the rat brain cortex in vivo［J］．Microvasc Res，1991，42:305－315．

［8］Oudega M．Molecular and cellular mechanisms underlying the role of blood vessels in spinal cord injury and repair［J］．Cell Tissue Res，2012，349:269 －288．

［9］Thurnher MM，Law M．Diffusion-weighted imaging，diffusion-tensor imaging，and fiber tractography of the spinal cord［J］．Magn Reson Imaging Clin N Am，2009，17:225－244．

［10］Wrathall JR，Pettegrew RK，Harvey F．Spinal cord contusion in the rat:production of graded，reproducible，injury groups［J］．Exp Neurol，1985，88:108 －122．

［11］Hawthorne AL，Popovich PG．Emerging concepts in myeloid cell biology after spinal cord injury［J］．Neurotherapeutics，2011，8:252－261．