丁黎艷， 郭晏華， 黃 婷， 張 蕾

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600)

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea coryfoliaL.的干燥成熟果實(shí)，具有補(bǔ)腎壯陽、納氣、止瀉之功。依據(jù)“腎主骨”、“補(bǔ)骨生髓”理論，許多補(bǔ)腎方藥用于治療骨質(zhì)疏松癥，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)有63個處方中用補(bǔ)骨脂來治療腎虛腰膝痛，骨痿、骨痹等［1-4］。目前已從補(bǔ)骨脂中分離鑒定得到50多種化學(xué)成分［5］，但炮制方面多集中對補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素［6-9］和補(bǔ)骨脂酚［10-11］含有量變化的研究，炮制工藝也以補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素［12-13］或總香豆素［14］為指標(biāo)。近期增加了炮制對補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂甲素含有量變化的報(bào)道［15］，但從藥效學(xué)角度篩選炮制化學(xué)成分指標(biāo)的研究還未見報(bào)道。以補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素和補(bǔ)骨脂乙素的量為炮制的指標(biāo)，也無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以此為突破口，建立補(bǔ)骨脂抗骨質(zhì)疏松成分的炮制評價(jià)方法。

利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法［16］尋找補(bǔ)骨脂中對組織蛋白酶K(Cathepsin K)有抑制作用的成分。采用 DOCK 6.0(http://dock.compbio.ucsf.edu/DOCK.6/index.htm)軟件，將組織蛋白酶 K(PDB代碼:3KWZ)三維結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)和補(bǔ)骨脂中33個化學(xué)成分 (立體結(jié)構(gòu))進(jìn)行分子對接。結(jié)果補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂色烯查耳酮、雙羥異補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂查耳酮、異補(bǔ)骨脂查耳酮 (補(bǔ)骨脂乙素)和補(bǔ)骨脂二輕黃酮與組織蛋白酶K具有較高親和力。得出補(bǔ)骨脂可能通過抑制組織蛋白酶K來發(fā)揮壯骨作用。通過文獻(xiàn)考察從這12個潛在活性成分中選取補(bǔ)骨脂甲素、乙素用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。以期望找到具有雙向調(diào)節(jié)作用的成分作為炮制指標(biāo)。又選擇了2010年版《中國藥典》中的指標(biāo)性成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素做活性篩選，具體操作如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 日本島津LC—10AT型雙泵高效液相色譜儀;SPD-10AVP紫外檢測器;UVmini—1240型紫外-可見分光光度計(jì);Sartorius CP225D型電子分析天平;KQ2200型超聲波清洗器。倒置顯微鏡(NOVEL，NIB—100型);CO2培養(yǎng)箱 (SANYO，MCO—15AC);CO2瓶 (99.5%);高速冷凍離心機(jī)(中佳，HC—2518R);超凈工作臺;冰箱 (新飛，BCD—201);高壓滅菌器。

1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基 (Gibco公司);PBS;小牛血清胰蛋白酶 (Gibco公司);Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)，青霉素，鏈霉素 (上海四藥股份);AKP試劑盒 (南京建成生物工程研究所，JCA0059);二甲基亞砜 (上海生物工程有限公司，DMSO)。乙腈、甲醇為色譜純 (天津科密歐有限公司);水為娃哈哈純凈水;其它試劑均為分析純。遼海牌食鹽 (遼寧鹽局總公司監(jiān)制);黃酒(紹興水鄉(xiāng)黃酒釀造有限公司)。補(bǔ)骨脂素 (批號:YY20110707)，異補(bǔ)骨脂素 (批號:YY20110707)，補(bǔ)骨脂甲素 (批號:YY91022-110617)，補(bǔ)骨脂乙素 (批號:YY9121-110629)均購于上海源葉生物科技有限公司。補(bǔ)骨脂炮制品均由沈陽藥材市場購進(jìn)，為同一批生品藥材炮制而成 (產(chǎn)地:云南)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定均為正品藥材。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 新生1 d SD大鼠 (清潔級)20只，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制指標(biāo)的篩選

2.1.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)供試品制備 精密稱定4種對照品各1 mg，分別溶于1 mL DMSO中 (4℃下放置48 h)的貯備液，各樣品再分別制成5 μg/mL，50 μg/mL，500 μg/mL的藥液過濾消毒除菌。

2.1.2 MTT法測定細(xì)胞增殖率 取新生SD大鼠成骨細(xì)胞，進(jìn)行原代與傳代培養(yǎng)，對處于對數(shù)生長期的成骨細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)，細(xì)胞以1×104個/mL密度，接種于96孔板，每孔200 μL，經(jīng)培養(yǎng)24 h后，用 PBS沖洗細(xì)胞，加入 100 μL/孔無血清DMEM培養(yǎng)液，饑餓細(xì)胞24 h，以使細(xì)胞周期同步化。棄去無血清培養(yǎng)液，加入含藥無血清培養(yǎng)液，每藥高、中、低質(zhì)量濃度，各重復(fù)5孔，每孔200 μL 培養(yǎng) 48 h。棄培養(yǎng)液，再加入 20 μL/孔MTT，37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄MTT溶液，最后加入150 μL/孔 DMSO，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀中492 nm，讀取OD值。

2.1.3 成骨細(xì)胞增殖率檢測結(jié)果 數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件處理，用成組t檢驗(yàn)比較各不同質(zhì)量濃度組與對照組的差異。成骨細(xì)胞增殖率檢測結(jié)果如表1所示，其中補(bǔ)骨脂素50 μg/mL組，異補(bǔ)骨脂素500 μg/mL組，補(bǔ)骨脂乙素50 μg/mL組與對照組OD值比較有非常顯著性差異 (P＜0.01)，補(bǔ)骨脂甲素50 μg/mL組，補(bǔ)骨脂甲素500 μg/mL組與對照組OD值比較有顯著性差異 (P＜0.05)。

表1 補(bǔ)骨脂中4種成分對大鼠成骨細(xì)胞OD值(±s)及增值率的影響 (n=5，48 h)Tab.1 Influence of four compounds in Psoralea corylifolia L.on the value of OD and proliferation of osteoblasts

表1 補(bǔ)骨脂中4種成分對大鼠成骨細(xì)胞OD值(±s)及增值率的影響 (n=5，48 h)Tab.1 Influence of four compounds in Psoralea corylifolia L.on the value of OD and proliferation of osteoblasts

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 質(zhì)量濃度/(μg·mL－1) OD490值 平均增值率/%空白對照 — 0.114 0±0.005 7—補(bǔ)骨脂素 5 0.154 0±0.018 6 42.592 6 50 0.178 0 ±0.014 7＊＊ 64.814 8 500 0.144 4±0.013 1 33.703 7異補(bǔ)骨脂素 5 0.146 2±0.009 1 35.370 3 50 0.150 4±0.008 4 39.259 2 500 0.133 0 ±0.012 66＊＊ 23.148 1補(bǔ)骨脂甲素 5 0.173 4±0.010 4 60.555 5 50 0.242 0±0.036 3* 124.074 500 0.224 2±0.037 0* 107.592補(bǔ)骨脂乙素 5 0.142 8±0.026 2 32.222 2 50 0.178 8 ±0.006 0＊＊ 65.555 5 500 0.204 4±0.012 8 89.259 2

2.1.4 結(jié)論 通過計(jì)算機(jī)篩選和成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，最終選擇補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素為炮制指標(biāo)。

2.2 不同炙法對抗骨質(zhì)疏松成分的影響 采用Kromasil-C18色譜柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)，摸索測定條件，最終以乙腈 (A)-0.3%冰乙酸(B)為流動相，梯度洗脫，0～10 min(63% ～55%B)，10～20 min(55% ～50%B)，20～30 min(50% ～45%B)，30～50 min(65% ～35%B);體積流量1.0 mL/min;柱溫為室溫。245 nm檢測波長下進(jìn)樣 10 μL。

2.2.1 供試品制備 生品 (產(chǎn)地:云南)采用鹽炙法［14］、雷 公 炙 法［17］、 乙 醇 炙 法［17］、 微 波 炙法［13］平行炮制3份，計(jì)算質(zhì)量差異系數(shù)，備用。鹽炙:精稱補(bǔ)骨脂100 g，加食鹽水50 mL(取2 g食鹽加水至50 mL)，室溫悶潤24 h，置150℃鍋中，以40次/min的翻炒頻率，炒炙10 min。雷公炙:精稱100 g補(bǔ)骨脂生品，加300 mL黃酒浸泡24 h，再用清水浸泡72 h，濾過蒸6 h，晾干。乙醇炙:將雷公炙中的黃酒換成95%的乙醇，其它操作同雷公炙法。微波法:精稱100 g補(bǔ)骨脂生品，20%食鹽水、浸泡6 h，強(qiáng)微波210 s。云南生品和4種炮制品粉末 (過60目篩)0.2 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入20 mL甲醇，超聲提取30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，靜置，上清液用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，即得［12］。

2.2.2 HPLC測定對照品制備 精密稱取4種對照品適量，分別置5 mL棕色量瓶中加甲醇溶解，制得質(zhì)量濃度為200.0 μg/mL的對照品貯備液，備用。最終確定采用補(bǔ)骨脂素21.2 μg/mL，異補(bǔ)骨脂素21 μg/mL，補(bǔ)骨脂甲素21.2 μg/mL，補(bǔ)骨脂乙素22 μg/mL的混合對照品，進(jìn)樣10 μL。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，在選定的色譜條件下補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素的理論塔板數(shù)均不少于3 000，樣品峰與其他峰的分離度均大于1.5，混合對照品及樣品色譜圖見圖1。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品4、8、10、12、16、20 μL注入高效液相色譜儀，測定。以進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到各成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表2。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取補(bǔ)骨脂藥材供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰面積，結(jié)果補(bǔ)骨脂素，異補(bǔ)骨脂素，補(bǔ)骨脂甲素，補(bǔ)骨脂乙素峰面積的RSD分別為1.3%、1.5%、1.9%和1.7%。結(jié)果表明，本方法精密度較好。

圖1 混合對照品 (A)、生品 (B)、鹽炙品 (C)、雷公炙品 (D)、乙醇炙品 (E)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixture reference substances(A)，raw sample(B)，salt-water product(C)，yellow wine product(D)，alcohol product(E)

表2 4種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab.2 Regression equations，correlation coefficients，and linear ranges of four compounds

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取補(bǔ)骨脂藥材供試品溶液在0、4、8、12、16 h分別進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，結(jié)果補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素峰面積的RSD均小于2%符合要求。結(jié)果表明，樣品在本實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批補(bǔ)骨脂藥材樣品5份，按供試品制備方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣分析，結(jié)果補(bǔ)骨脂素1.5%，異補(bǔ)骨脂素1.9%，補(bǔ)骨脂甲素2.1%和補(bǔ)骨脂乙素2.0%。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性較好。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的云南生品藥材5份，每份約0.1 g(補(bǔ)骨脂素1.275 mg/g，異補(bǔ)骨脂素1.478 mg/g，補(bǔ)骨脂甲素1.834 mg/g，補(bǔ)骨脂乙素2.705 mg/g)精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素和補(bǔ)骨脂乙素與樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)相當(dāng)?shù)膶φ掌?，照供試品溶液制備方法制備。求得平均回收率分別為98.3%、98.6%、102.3%和98.0%;RSD分別為2.1%、1.7%、2.2%、2.5%。結(jié)果表明，本方法回收率較高。

2.2.9 樣品測定結(jié)果 取所收集的4個不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂藥材及4種炮制品 (產(chǎn)地:云南)，在上述色譜條件下進(jìn)行測定并計(jì)算4種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3、表4。

表3 4種成分測定結(jié)果 (mg/g，n=3)Tab.3 Analytical results of four compounds(mg/g，n=3)

表4 補(bǔ)骨脂中不同炙法對4種成分的影響 (mg/g，n=3，云南)Tab.4 Analytical results of four compounds in four processed products(mg/g，n=3，Yunnan)

3 討論

3.1 不同炮制方法對抗骨質(zhì)疏松活性成分測定的分析 采用本研究建立的方法對4個產(chǎn)地的補(bǔ)骨脂藥材及其炮制品進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，4個指標(biāo)成分之間質(zhì)量分?jǐn)?shù)差別較大，補(bǔ)骨脂素為1.805～3.650 mg/g，異補(bǔ)骨脂素為1.718～3.271 mg/g，補(bǔ)骨脂甲素為1.417～5.944 mg/g，補(bǔ)骨脂乙素為3.321 ～7.226 mg/g。

不同炙法對4種成分量的影響也不同。說明現(xiàn)有炮制方法對補(bǔ)骨脂的潛在抗骨質(zhì)疏松成分有影響。雷公炙與95%乙醇炙與生品比顯著提高了補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素的量，分別為146.6%、144.9%(雷公炙)和66.30%、57.43%(乙醇炙)。但乙醇炙法總量卻較生品低，因此醇炙不能代替雷公炙法。微波炙法較生品補(bǔ)骨脂甲素和補(bǔ)骨脂乙素增加了18.05%、1.090%。

3.2 炮制研究思路探討 中藥炮制是怎樣通過影響其物質(zhì)基礎(chǔ)，來發(fā)揮某些特定藥效的研究，即“炮制→化學(xué)→藥效”的思路，常用來評價(jià)現(xiàn)有炮制方法的科學(xué)性。從中醫(yī)角度考慮，臨床應(yīng)用可根據(jù)其不同目的選擇不同的炮制方法:如補(bǔ)骨脂要加強(qiáng)補(bǔ)腎壯陽作用，史料記載可選用雷公炙或鹽炙。針對藥效炮制，一直是中醫(yī)臨床所遵循的原則，而本實(shí)驗(yàn)所采用的“藥效篩選→化學(xué)指標(biāo)→炮制”的研究思路，可直接為臨床應(yīng)用確定新的炮制工藝奠定理論基礎(chǔ)。

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