田成旺， 郭建華， 張 科， 張鐵軍， 蔣伶活

(1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072;2.天津藥物研究院，天津 300193;3.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070;4.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122)

射黃含片源于“古今濟(jì)生妙方”的黃芩射干湯，由射干和黃芩兩味藥材組成，用于治療咽喉腥臭［1］?，F(xiàn)代研究表明，射干中含有異黃酮、酚類、苯醌類等成分［2-3］，具有明顯的抗炎及抗病毒作用［4-6］;黃芩中含有黃酮等成分，并具有抗炎、解熱、抗病毒等作用［7-8］。本課題組采用樹脂純化、噴霧干燥、干法制粒等現(xiàn)代制備工藝將射干和黃芩制成射黃含片，臨床用于急性咽炎及慢性咽炎急性發(fā)作期出現(xiàn)的咽喉干燥，灼熱，疼痛等，效果顯著。為有效評(píng)價(jià)射黃含片的質(zhì)量，確保臨床的有效性和安全性，在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上［9-12］，本實(shí)驗(yàn)研究并建立了射黃含片中射干和黃芩的薄層色譜鑒別方法，采用反相高效液相色譜法同時(shí)對(duì)主要活性成分射干苷、黃芩苷和次野鳶尾黃素進(jìn)行了定量測(cè)定。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Dionex液相系統(tǒng)，Chromeleon色譜工作站，配置自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器;電子天平:sartovius(十萬分之一天平);METTLER TOLEDO(萬分之一天平)。超聲儀:AUTOSCIENCE(AS3120)。

1.2 試藥 黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)110715-200514)、射干苷對(duì)照品 (批號(hào)111632-200501)和次野鳶尾黃素 (批號(hào)1557-200101)均購自中國藥品生物制品檢定所;射黃含片，自制，批號(hào)分別為110401，110402，110403;水為雙蒸水，甲醇為色譜純，其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 射干的鑒別 取本品粉末1.0 g，加水20 mL，超聲處理15 min，濾過，水液加三氯甲烷萃取3次，每次20 mL，水層揮干三氯甲烷，再用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯層，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取射干苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.6 mg的溶液作為射干苷對(duì)照品溶液;另取射干對(duì)照藥材1.0 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至約1 mL，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版·一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液及對(duì)照品和對(duì)照藥材溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一塊硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸 (20∶3∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，直接置于紫外燈(254 nm)下檢視，或噴以2%AlCl3試液后晾干，再置于紫外燈 (254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光淬滅斑點(diǎn)，噴以AlCl3試液后，斑點(diǎn)仍然清晰。陰性對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖1。

2.2 黃芩的鑒別 取射黃含片粉末0.5 g，加水20 mL，超聲處理15 min，濾過，水液加10%鹽酸調(diào)pH至3.0，過濾，水液棄去，沉淀加甲醇使其溶解，作為供試品溶液。取黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL約含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液;另取黃芩對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇15 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至約1 mL，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部 附錄ⅥB)試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水 (5∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%FeCl3乙醇溶液，105℃下烘烤至顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同綠顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖2。

圖1 射干薄層色譜圖Fig.1 TLC of Belamcandae Rhizoma

圖2 黃芩的薄層色譜圖Fig.2 TLC of Scutellariae Radix

3 樣品測(cè)定

3.1 樣品制備

3.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、射干苷和次野鳶尾黃素對(duì)照品適量，加甲醇配制成每1 mL含黃芩苷0.07 mg、射干苷0.02 mg和次野鳶尾黃素0.01 mg的溶液。

3.1.2 供試品溶液的制備 取射黃含片適量，研細(xì)，取0.1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理 (功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.1.3 陰性樣品溶液的制備 按照射黃含片的制備工藝分別制得缺黃芩和缺射干的陰性樣品，取陰性樣品，研細(xì)，取0.1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理 (功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 試驗(yàn)Diamonsil C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相甲醇－0.05%磷酸 (42∶58);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長270 nm;柱溫30℃。分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，理論塔板數(shù)以射干苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000;射干苷、黃芩苷、次野鳶尾黃素與其它組分的分離度都大于1.5，且陰性無干擾。見圖3。

圖3 混合對(duì)照品 (A)、樣品 (B)、缺射干陰性樣品 (C)和缺黃芩陰性樣品 (D)液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of mixed substances(A)，sample(B)，negative sample without Belamcande Rizoma(C)and negative sample without Scutellariae Radix(D)

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取上述黃芩苷、射干苷和次野鳶尾黃素混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12 μL進(jìn)行色譜測(cè)定，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，并以峰面積 (y)對(duì)進(jìn)樣量 (x)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線:黃芩苷Y=21.56X+234.35，r=0.999 6;射干苷Y=49.11X－635.11，r=0.999 8;次野鳶尾黃素Y=53.22X+117.21，r=0.999 9。表明黃芩苷在140～840 ng，射干苷在40～240 ng，次野鳶尾黃素在20～120 ng進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3.2 精密度試驗(yàn) 取黃芩苷、射干苷和次野鳶尾黃素的混合對(duì)照品溶液10 μL連續(xù)進(jìn)樣，測(cè)定6次，RSD分別為0.54%、1.12%、1.46%，表明儀器精密度良好。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液 (批號(hào)110401)在0、2、4、6、8、12h分別進(jìn)樣10 μL，黃芩苷、射干苷和次野鳶尾黃素的RSD分別為1.31%、1.45%、1.77%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào) (批號(hào)110401)樣品6份，按3.1.2項(xiàng)下的制備方法處理，進(jìn)樣檢測(cè)，根據(jù)樣品圖譜中測(cè)得的黃芩苷、射干苷和次野鳶尾黃素峰面積，代入線性方程中進(jìn)行計(jì)算相應(yīng)的溶液質(zhì)量濃度，并由溶液體積和稱樣量求得相應(yīng)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。測(cè)得射黃含片中黃芩苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為63.05 mg/g(RSD為1.16%)，射干苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.88 mg/g(RSD為1.33%)，次野鳶尾黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.11 mg/g(RSD為1.25%)，結(jié)果表明分析方法重復(fù)性良好。

3.3.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取射黃含片樣品(批號(hào)110401)共9份，加入相應(yīng)量的黃芩苷、射干苷、次野鳶尾黃素對(duì)照品，按3.1.2項(xiàng)下的制備方法處理并測(cè)定，進(jìn)樣檢測(cè)，并計(jì)算回收率。黃芩苷平均回收率為98.89%，RSD為1.63%;射干苷平均回收率為100.32%，RSD為1.06%;次野鳶尾黃素的平均回收率為98.65%，RSD為1.53%。表明本方法準(zhǔn)確可靠，結(jié)果見表1～3。

3.4 樣品測(cè)定 取射黃含片3個(gè)批號(hào)樣品，按3.1.2項(xiàng)下的制備方法處理后測(cè)定，獲得黃芩苷、射干苷及次野鳶尾黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4。

由表中數(shù)據(jù)可以看出，3批射黃含片中黃芩苷、射干苷和次野鳶尾黃素的量基本保持穩(wěn)定。

表1 黃芩苷回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Tab.1 Results of recovery tests of baicalin(n=9)

表2 射干苷回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests of tectoridin(n=9)

表3 次野鳶尾黃素回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Tab.3 Results of recovery tests of irisflorentin(n=9)

表4 射黃含片中黃芩苷、射干苷和次野鳶尾黃素的測(cè)定結(jié)果(n=3，±s)Tab.4 Determination of baicalin，tectoridin and irisflorentin in Shehuang Lozenges(n=3，±s)

表4 射黃含片中黃芩苷、射干苷和次野鳶尾黃素的測(cè)定結(jié)果(n=3，±s)Tab.4 Determination of baicalin，tectoridin and irisflorentin in Shehuang Lozenges(n=3，±s)

批號(hào) 黃芩苷/(mg·g－1)(RSD/%)射干苷/(mg·g－1)(RSD/%)次野鳶尾黃素/(mg·g－1)(RSD/%)110401 63.05±0.063(0.99) 9.881±0.009(0.91) 0.712±0.001(1.35)114002 60.29±0.052(0.86) 9.550±0.012(1.22) 0.733±0.002(0.98)110403 62.69±0.075(1.21) 9.413±0.010(1.06) 0.695±0.001(1.41)

4 討論

4.1 在射干的薄層鑒別中，考慮到射干中主要活性成分為異黃酮類成分，其中射干苷為其代表性成分，在供試品溶液制備方面，采用水超聲提取，三氯甲烷萃取除雜，乙酸乙酯萃取的方法，可有效提取有效成分和減少雜質(zhì)帶來的干擾。先后比較了硅膠G板、硅膠GF254板等薄層板，發(fā)現(xiàn)硅膠GF254板重現(xiàn)性更為理想，先后采用①三氯甲烷-丁酮-甲醇(3∶1∶1)、②三氯甲烷-甲醇-冰醋酸 (10∶1∶0.1)、③三氯甲烷-甲醇-冰醋酸 (20∶3∶0.5)展開劑系統(tǒng)為展開劑，結(jié)果系統(tǒng)③較為理想，置于紫外254 nm下檢視，結(jié)果顯示圖譜效果較好，在噴以AlCl3試液顯色后，斑點(diǎn)仍清晰。

4.2 黃芩的薄層鑒別中，考慮到黃芩主要含有黃酮類成分，其中黃芩苷為其代表性成分，在供試品溶液制備方面，采用水溶酸沉的方法，可有效地提取有效成分和減少雜質(zhì)帶來的干擾。先后比較了聚酰胺膜、硅膠G板等薄層板，發(fā)現(xiàn)硅膠G板重現(xiàn)性更為理想，采用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水 (5∶3∶1∶1)為展開劑，噴以1%的FeCl3乙醇試液，結(jié)果顯示圖譜效果較好。

4.3 射黃含片由射干和黃芩兩味藥組成，主要活性成分包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、射干苷、次野鳶尾黃素等黃酮類成分，其中次野鳶尾黃素、黃芩苷分別為2010年《中國藥典》射干和黃芩項(xiàng)下的含量限度指標(biāo)，同時(shí)考慮到射干中射干苷量較高，本實(shí)驗(yàn)選取黃芩苷、射干苷、次野鳶尾黃素作為指標(biāo)進(jìn)行定量測(cè)定研究。

4.4 因本實(shí)驗(yàn)建立的方法為同時(shí)檢測(cè)黃芩苷、射干苷和次野鳶尾黃素成分，為保證檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，我們對(duì)色譜條件進(jìn)行了考察，通過對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波長掃描，確定其較佳吸收波長為270 nm;通過對(duì)乙腈－水、甲醇－水等流動(dòng)相組成及其比例的考察確定了合適的流動(dòng)相;通過對(duì)回流、超聲、索氏提取等不同提取方式，不同的溶劑、用量和提取時(shí)間進(jìn)行系統(tǒng)考察，確定了供試品的最佳制備方法。研究結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法簡便易行且準(zhǔn)確可靠。

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