汪江濤， 丁伯平， 柏 松， 陳 莉， 黃幀檜

(皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室及中藥藥理國家三級實(shí)驗(yàn)室，安徽蕪湖 241002)

中葉素是美國斯坦福大學(xué)Roh等［1］運(yùn)用生物信息學(xué)理論所發(fā)現(xiàn)的一個降鈣素基因相關(guān)肽 (calcitonin gene－related peptide，CGRP)家族的新的血管活性肽，與日本學(xué)者2004年發(fā)現(xiàn)的腎上腺家族的新肽腎上腺髓質(zhì)素2(adrenomedullin2，ADM2)在核苷酸和氨基酸序列上完全相同，認(rèn)為兩者是同一物質(zhì)［2］，具有舒張血管、降低血壓、保護(hù)心功能等生物學(xué)效應(yīng)［3－4］，中葉素可與任意一種 CGRP家族特異性受體復(fù)合物結(jié)合，該受體復(fù)合物由降鈣素受 體 樣 受 體 (calcitonin receptor－like receptor，CRLR)和受體活性修飾蛋白 (receptor activity modifying proteins，RAMPs)構(gòu)成，包括 CRLR/RAMP1、CRLR/RAMP2、CRLR/RAMP3，是重要的心血管保護(hù)因子之一。鉤藤為茜草科植物鉤藤或華鉤藤及其同屬的多種植物的帶鉤枝條，鉤藤堿為其主要有效活性成分［5］，具有降壓、鎮(zhèn)靜等作用［6－7］。但鉤藤堿對腎性高血壓心肌保護(hù)報道較少，本實(shí)驗(yàn)在兩腎一夾腎性高血壓大鼠模型的基礎(chǔ)上，初步探討鉤藤堿心肌保護(hù)是否與內(nèi)皮素 (ET－1)和中葉素及其受體表達(dá)有關(guān)，為鉤藤堿臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量160～180 g，購自南京青龍山實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號:SCXK(滬)2008－0016，分籠飼養(yǎng)，每籠一只，保持溫度 (25±2)℃，相對濕度60% ±10%，自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥品與試劑 98%鉤藤堿 (南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，批號:ZL110715);尼卡地平 (安斯泰來制藥 (中國)有限公司，批號:B027Y01)。羥脯氨酸 (Hyp)檢測盒 (南京建成生物工程研究所，批號:20111120);內(nèi)皮素 (ET－1)放射免疫藥盒，北京北方生物技術(shù)研究所 (批號:20111120);大鼠降鈣素受體樣蛋白 (CRLR)ELISA檢測試劑盒 (蘇州卡爾文生物工程有限公司，批號:CK－E91835R)。兔抗中葉素多克隆抗體(編號:bs－2985R，批號:990292)，SP免疫組化檢測試劑盒 (兔)(編號:SP－0023)，DAB試劑盒均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。TRNzol－A+，RNase－free ddH2O，超純 dNTP，Oligo dt15均購于天根生化科技 (北京)有限公司 (批號分別為#J9117;#L0517;#L0314;#L0301);PCR引物由南京金斯瑞生物工程科技有限公司合成。

1.3 儀器 GC—1200型γ放射免疫計數(shù)器 (科大股份公司);KDC—2042恒溫高速離心機(jī) (科大股份公司);EG1160組織包埋機(jī) (德國LEICA);RM2245組織切片機(jī) (德國LEICA);Elx 800全自動酶標(biāo)儀 (美國寶特儀器有限公司);勻漿儀(PRO 250);JD801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng) (江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司);高速冷凍離心機(jī)(Heraeus);基因擴(kuò)增儀EDC—810(東勝國際貿(mào)易有限公司);瑞士產(chǎn)微量加樣儀;瑞士產(chǎn)連續(xù)加樣儀。

1.4 兩腎一夾高血壓模型的復(fù)制及處理 60只雄性清潔級SD大鼠，觀察適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)抽取8只作為假手術(shù)組，52只為造模組，對造模組大鼠進(jìn)行兩腎一夾手術(shù)，大鼠術(shù)前禁食過夜，自由飲水。以25%烏拉坦 (4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，玻璃分針分離左腎動脈，放置內(nèi)徑為0.20 mm的銀夾打結(jié)并固定。假手術(shù)組同樣分離腎動脈，但不放置銀夾，依次縫合肌肉和皮膚。手術(shù)后4 h內(nèi)肌肉注射40萬單位的青霉素，連續(xù)注射3 d以預(yù)防感染，術(shù)后正常進(jìn)食與喂水。無創(chuàng)尾動脈血壓測量儀測定正常大鼠清醒手術(shù)前、手術(shù)后及用藥后尾動脈壓。手術(shù)后4周收縮后達(dá)160 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)為造模成功［8］，入選給藥組。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為5組 (見表1):模型組 (n=8)、鉤藤堿高劑量組 ［10.0 mg/(kg·d)，n=8］、鉤藤堿中劑量組 ［5.0 mg/(kg·d)，n=8］、鉤藤堿低劑量組 ［2.5 mg/(kg·d)，n=8］、尼卡地平組 ［0.1 mg/(kg·d)，n=8］。手術(shù)后5周開始給藥，鉤藤堿高、中、低劑量組和尼卡地平組腹腔注射給藥連續(xù)8周;模型組和假手術(shù)組腹腔注射等量的生理鹽水。

表1 大鼠造模后的收縮壓、舒張壓變化 (mmHg，±s，n=8)Tab.1 Changes of systolic pressure and diastolic pressure(mmHg，±s，n=8)

表1 大鼠造模后的收縮壓、舒張壓變化 (mmHg，±s，n=8)Tab.1 Changes of systolic pressure and diastolic pressure(mmHg，±s，n=8)

注:與假手術(shù)組相比，ΔΔP＜0.01。

組 別 劑量/(mg·kg －1)術(shù)后4周收縮壓 舒張壓假手術(shù)組115.7±9.2 80.2±9.1模型組 169.8±11.2ΔΔ130.3±11.6ΔΔ鉤藤堿高劑量組 10.0 171.1 ±9.8ΔΔ 132.3±13.6ΔΔ鉤藤堿中劑量組 5.0 170.7±10.8ΔΔ133.9±12.2ΔΔ鉤藤堿低劑量組 2.5 172.6±12.6ΔΔ131.9±10.6ΔΔ尼卡地平組 0.1 170.3±14.3ΔΔ 129.7±9.6ΔΔ

1.5 全心質(zhì)量指數(shù) (HM/BM)的測定和心肌Hyp、ET－1、CRLR的測定 給藥8周后稱定質(zhì)量處死，迅速開胸取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗后濾紙吸干，稱量全心質(zhì)量 (mg)和大鼠體質(zhì)量(g)，計算全心質(zhì)量指數(shù);準(zhǔn)確稱取心肌組織，按質(zhì)量體積比1∶9加0.86%冷生理鹽水，制成10%的組織勻漿，4℃，3 000 r/min離心10 min，分離上清液后用堿水解法測定Hyp的水平，放射免疫法測定ET－1水平，ELISA法測定 CRLR水平，勻漿制備過程在4℃條件下進(jìn)行，并在15 min內(nèi)完成。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測中葉素在心肌組織中蛋白的表達(dá) 心肌組織置入10%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，脫蠟入水，30%H2O21份和蒸餾水10份混合，室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次;將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液 (pH 6.0)，高壓鍋加熱至沸騰后斷電，間隔10 min，反復(fù)2次，冷卻后用PBS(pH 7.2)洗滌2次;滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗;滴加兔抗中葉素單克隆抗體(1∶150)，4℃孵育過夜;PBS(pH7.2)洗5 min 3次;滴加二抗37℃放置30 min，PBS(pH7.2)洗5 min 3次;滴加試劑SABC，37℃ 30 min，PBS(pH 7.2)洗5 min 4次;使用DAB顯示試劑盒，室溫顯色，顯微鏡下觀察染色程度，蒸餾水洗滌終止反應(yīng);蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡檢。結(jié)果判定:低倍鏡和高倍鏡觀察切片，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰的為陽性細(xì)胞，胞漿染成棕黃色。應(yīng)用IPP 6.0對結(jié)果進(jìn)行半定量分析，以累計光密度值(IOD)進(jìn)行比較。

1.7 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT－PCR)分析RAMPs mRNA表達(dá) 大鼠處死后迅速去心肌組織100 mg，用 Trizol一步提取法提取組織的總RNA。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入RNA 2 μg，10×RT Mix 2 μL，dNTP 混合液 2 μL，Oligo－dT152 μL，Quant Reverse Transcriptase 1 μL，最后加入 RNasefree水，使反應(yīng)總體積達(dá)到20 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系在37℃下反應(yīng)60 min，在70℃下15 min使產(chǎn)物變性。引物序列見表2。PCR反應(yīng)體系如下［9］:1 μL 模板 cDNA，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，加入雙蒸水使反應(yīng)總體積達(dá)到25 μL。RAMP1和 RAMP2反應(yīng)條件:變性94℃4 min;擴(kuò)增 (31個循環(huán)):94℃30 s，60℃ 45 s，72℃ 35 s;末次循環(huán)后，72℃再延伸5 min;RAMP3反應(yīng)條件:變性94℃4 min;擴(kuò)增 (33個循環(huán)):94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 35 s;末次循環(huán)后，72℃再延伸5 min;?actin反應(yīng)條件:變性94℃4 min;擴(kuò)增 (25個循環(huán)):94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 35 s;末次循環(huán)后，72℃再延伸5 min。取PCR產(chǎn)物8 μL加5×Loading Buffer 2 μL于2%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析心肌組織中RAMP1、RAMP2和RAMP3 mRNA的表達(dá)，結(jié)果以目的條帶的光密度與相關(guān)β－actin mRNA光密度的比值表示。

表2 RT-PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物及反應(yīng)條件Tab.2 Oligonucleotides used for the amplification and reaction conditions

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件分析，結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠 HM/BM、Hyp、ET－1、CRLR的變化給藥8周后，與假手術(shù)組相比，模型組HM/BM、Hyp、ET－1、CRLR均有顯著提高 (P＜0.01);與模型組相比，鉤藤堿高、中劑量組及尼卡地平組HM/BM、Hyp、ET－1下降，CRLR上升，差異有顯著性 (P＜0.01)，低劑量組能一定程度的降低HM/BM，升高CRLR(P＜0.05)，見表3。

2.2 心肌組織中中葉素的蛋白表達(dá) 通過免疫組化染色可以看出，中葉素主要表達(dá)在心肌組織的胞漿中，與假手術(shù)組相比，中葉素在模型組大鼠心肌組織的中表達(dá)升高58.65%(P＜0.01);與模型組相比，鉤藤堿高、中、低劑量組和尼卡地平組在心肌組織中中葉素蛋白水平的表達(dá)分別升高1.95倍、97.07%、27.92%和1.91倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，見圖1，表4。

表3 各組HM/BM、Hyp、ET-1、CRLR的變化 (±s，n=8)Tab.3 Changes of HM/BM，Hyp，ET-1，CRLR in all groups(±s，n=8)

表3 各組HM/BM、Hyp、ET-1、CRLR的變化 (±s，n=8)Tab.3 Changes of HM/BM，Hyp，ET-1，CRLR in all groups(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01;與模型組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組 別 全心質(zhì)量指數(shù)/(mg·g－1) 羥脯氨酸/(mg·g－1) 內(nèi)皮素/(pg·mL－1) 降鈣素受體樣蛋白(pg·mL－1)假手術(shù)組2.77±0.19 0.44±0.08 3.17±0.46 210.8±17.1模型組 3.61±0.22ΔΔ 0.87±0.11ΔΔ 6.25±0.72ΔΔ 275.5±19.9ΔΔ鉤藤堿高劑量組 2.92±0.23★★ 0.47±0.09★★ 3.37±1.02★★ 452.5±20.5ΔΔ★★鉤藤堿中劑量組 3.05±0.24Δ★★ 0.68±0.11ΔΔ★★ 4.54±1.31Δ★★ 389.5±23.2ΔΔ★★鉤藤堿低劑量組 3.32±0.21ΔΔ★ 0.81±0.08ΔΔ 5.63±0.98ΔΔ 300.3±20.8ΔΔ★尼卡地平組 2.87±0.24★★ 0.46±0.09★★ 3.32±0.85★★ 453.9±21.1ΔΔ★★

圖1 各組大鼠心肌組織中中葉素的蛋白表達(dá) (×400)Fig.1 Intermedin level in myocardium protein expression in all groups

表4 各組大鼠心肌組織中葉素的蛋白表達(dá)(以累積光密度進(jìn)行比較)(±s，n=8)Tab.4 Intermedin level in myocardium protein expressionin all groups(compared with IOD)(±s，n=8)

表4 各組大鼠心肌組織中葉素的蛋白表達(dá)(以累積光密度進(jìn)行比較)(±s，n=8)Tab.4 Intermedin level in myocardium protein expressionin all groups(compared with IOD)(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組 別 心肌中葉素蛋白表達(dá)水平假手術(shù)組11 833.1±1 994.6模型組 18 774.4±4 478.7△△鉤藤堿高劑量組 55 459.6±4 342.8△△★★鉤藤堿中劑量組 36 999.4±3 707.1△△★★鉤藤堿低劑量組 24 017.2±3 664.3△△★尼卡地平組 54 740.5±3 750.7△△★★

2.3 心肌組織中RAMPs mRNA表達(dá)的變化 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織的 RAMP1、RAMP2、RAMP3 mRNA的表達(dá)顯著提高 (P＜0.01);給藥后，與模型組相比，鉤藤堿高、中、低劑量組和尼卡地平組均能不同程度的提高RAMPs mRNA的表達(dá)，差異有顯著性 (P＜0.01或P＜0.05)，鉤藤堿給藥組對RAMP2、RAMP3 mRNA表達(dá)的上調(diào)更顯著，見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織RAMPs mRNA的表達(dá) (±s，n=8)Fig.2 Expression of RAMPs mRNA in myocardium in all groups(±s，n=8)

3 討論

近些年來研究表明血管活性肽在高血壓病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起著極其重要的作用;中葉素是2004年新發(fā)現(xiàn)的一種血管活性肽，在心血管系統(tǒng)具有降低大鼠外周阻力［10］，舒張大鼠血管［11］，并且在減少心肌梗死面積、改善心功能［3－4］以及心肌纖維化和心肌缺血損傷和中發(fā)揮著重要的作用［12－14］。腎性高血壓是一種由于腎動脈狹窄而造成腎血流量減少而激活腎素－血管緊長素系統(tǒng)(RAS)造成的一種常見的繼發(fā)性高血壓，存在明顯的心肌肥厚和纖維化，本實(shí)驗(yàn)采用兩腎一夾方法復(fù)制繼發(fā)性高血壓模型，采用鉤藤堿和尼卡地平進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示:造模后，HM/BM、Hyp均有顯著提高，反映了心肌細(xì)胞的增生與肥厚及纖維化程度;心肌組織中ET－1、CRLR、中葉素及RAMPs mRNA的表達(dá)升高，提示在腎性高血壓時機(jī)體代償性增加中葉素的水平，其與賈月霞等［15］報道基本一致;給藥后，鉤藤堿各劑量均能不同程度的降低HM/BM、Hyp，顯示其具有心肌保護(hù)的作用。而ET－1水平降低，CRLR、中葉素及 RAMPs mRNA的表達(dá)升高，提示給藥鉤藤堿后機(jī)體可能通過上調(diào)心肌中葉素及其受體的表達(dá)和降低ET－1的水平來對抗高腎素和AngⅡ引起心臟負(fù)荷增加等效應(yīng)，產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。

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