李 煒， 吳云生， 馬久太， 劉 峰， 楊廣德

(1.西安交通大學(xué)藥學(xué)系，陜西西安 710061;2.步長(zhǎng)制藥科研部，陜西西安 712000)

療癬卡西甫丸是具有維族特色的傳統(tǒng)藥物，由黃連、菝葜、白芝麻、歐菝葜根四味藥制成，具有清除堿性異常黏液質(zhì)，燥濕，止癢的功效，臨床用于肌膚瘙癢，體癬，牛皮癬等［1-2］。目前尚未見(jiàn)其質(zhì)量研究的報(bào)道，為有效控制本品質(zhì)量，參考有關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究。根據(jù)處方中藥材和輔料的成分及其理化性質(zhì)，采用薄層色譜法對(duì)制劑中黃連、白芝麻、菝葜和歐菝葜進(jìn)行定性鑒別，對(duì)黃連中有效成分鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀，采用高效液相色譜法進(jìn)行定量測(cè)定。結(jié)果表明，TLC鑒別方法和HPLC測(cè)定方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SSI高效液相色譜儀 (UV/VIS 400型紫外檢測(cè)器;P4000泵;HW—2000色譜工作站);BP210D電子天平 (德國(guó)賽多利斯);AS3120超聲波清洗器 (天津奧特賽斯儀器有限公司)。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對(duì)照品 (批號(hào)110713-200911，按含C20H18ClNO4為86.8%計(jì));黃連對(duì)照藥材 (批號(hào)120913-200407);芝麻素對(duì)照品(批號(hào)110836-200103);β-谷甾醇對(duì)照品 (批號(hào)110851-200504);薯蕷皂苷元對(duì)照品 (批號(hào)111539-200001);鹽酸巴馬汀對(duì)照品 (批號(hào)110732-200907，按含 C21H22ClNO4為 86.1%計(jì))。以上對(duì)照品和對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈為HPLC級(jí) (美國(guó)TEDIA公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純 (西安化學(xué)試劑廠)。療癬卡西甫丸 (陜西步長(zhǎng)制藥有限公司生產(chǎn);批號(hào)為20091001、20091002、20091003;每袋裝10 g)。

2 鑒別

2.1 黃連的薄層色譜鑒別［1，3］取研細(xì)后的本品約5 g，加甲醇15 mL，超聲提取20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。取除去黃連的陰性制劑，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取黃連對(duì)照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液;再取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-氨水 (6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)為展開(kāi)劑 (一側(cè)槽中加入展開(kāi)劑，另一槽中加入等體積的濃氨試液，預(yù)平衡15 min)，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈 (365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，缺黃連的陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 黃連的TLC圖譜Fig.1 TLC chromatogram of Coptidis Rhizoma

2.2 菝葜和歐菝葜根的薄層色譜鑒別［3-6］取研細(xì)后的本品約15 g，加甲醇50 mL，超聲提取30 min，濾過(guò)，濾液加鹽酸6 mL，加熱回流水解1 h，放涼，用石油醚 (60～90℃)萃取2次 (25 mL，20 mL)，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。取除去菝葜和歐菝葜根的陰性制劑，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取薯蕷皂苷元對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺菝葜和歐菝葜根的陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

2.3 白芝麻的薄層色譜鑒別［1，7-9］取研細(xì)后的本品約1 g，加正己烷15 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液濃縮至適量，加約2 g中性氧化鋁，攪拌均勻，揮干溶劑，置中性氧化鋁柱 (100～200目，柱高3 cm，內(nèi)徑1.5 cm)上，用三氯甲烷洗脫，收集第20～40 mL的洗脫液，濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取除去白芝麻的陰性制劑，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取芝麻素對(duì)照品及β-谷甾醇對(duì)照品，加三氯甲烷分別制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(9∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺白芝麻的陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

圖2 菝葜和歐菝葜根的TLC圖譜Fig.2 TLC chromatogram of Smilacis chinae Rhizoma and Sarsaparillae Radix

圖3 白芝麻的TLC圖譜Fig.3 TLC chromatogram of white sesame seeds

3 HPLC 測(cè)定［3，10-11］

3.1 色譜條件 Luna ODS色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);乙腈－0.1%磷酸溶液 (40∶60，每100 mL含十二烷基硫酸鈉0.1 g)為流動(dòng)相;柱溫為30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm;體積流量為1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。見(jiàn)圖4。

圖4 療癬卡西甫丸HPLC圖Fig.4 HPLC chromatograms of Liaoxuan Kaxifu Pills

3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀對(duì)照品適量，分別加甲醇制成每1 mL分別含鹽酸小檗堿0.03 mg和鹽酸巴馬汀0.01 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備 取裝量差異檢查項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約1.2 g，精密稱(chēng)定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加鹽酸-甲醇 (1∶100)的混合溶液25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，60℃水浴中加熱15 min，取出，超聲提取30 min，室溫放置過(guò)夜，再稱(chēng)定質(zhì)量，用鹽酸-甲醇 (1∶100)的混合溶液補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2 mL置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過(guò) (0.45 μm)，即得。

3.4 線(xiàn)性關(guān)系的考察 分別取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液 (0.281 6 mg/mL)和鹽酸巴馬汀對(duì)照品溶液(0.083 1 mg/mL)1、2、3、4、5 mL依次置 25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，按上述色譜條件進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) (X)，峰面積為縱坐標(biāo) (Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為Y=162 983X－1 368.5，r=0.999 2;Y=148 357X+331.9，r=0.999 5。鹽酸小檗堿在 0.112 6～0.563 2 μg范圍內(nèi)、鹽酸巴馬汀在 0.033 24～0.166 2 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

3.5 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，以鹽酸小檗堿峰面積計(jì)算RSD為1.02%，以鹽酸巴馬汀峰面積計(jì)算RSD為1.21%。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算得鹽酸小檗堿RSD為1.68%，鹽酸巴馬汀RSD為1.56%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按處方比例制備缺黃連的陰性對(duì)照溶液，照上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照在相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，表明其他組分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖4。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批制劑 (20091001)，按上述供試品溶液制備方法分別制備6份溶液，在上述色譜條件下測(cè)定鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀，鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的 RSD分別為1.98%、1.88%。

3.9 回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取已知量的供試品約0.5 g(20091001)，共6份，分別加入一定量鹽酸小檗堿對(duì)照品和鹽酸巴馬汀對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，測(cè)定鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的量。鹽酸小檗堿平均回收率為97.6%，RSD為1.55%;鹽酸巴馬汀平均回收率為96.8%，RSD為1.92%。

3.10 樣品測(cè)定 按上述色譜條件測(cè)定3批制劑中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀量，結(jié)果鹽酸小檗堿含有量分別為28.4、31.1和30.6 mg/袋;鹽酸巴馬汀含有量分別為8.42、9.16和8.6 mg/袋。

4 討論

［1］方法鑒別制劑中芝麻素、β-谷甾醇，結(jié)果芝麻素斑點(diǎn)易受其它成分干擾，重復(fù)性差，難于判定。研究采用中性氧化鋁柱除雜的方法，可基本消除背景色及臨近點(diǎn)對(duì)芝麻素鑒別的影響，重復(fù)性好。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，菝葜中也含有β-谷甾醇［4］，但采用本鑒別方法缺白芝麻的陰性制劑在對(duì)應(yīng)位置無(wú)干擾，分析可能是本品處方中白芝麻用量遠(yuǎn)大于菝葜用量，并且白芝麻中β-谷甾醇量較菝葜中高。

曾比較了甲醇-水-磷酸、乙腈-磷酸二氫鈉溶液等系統(tǒng)［12-14］，結(jié)果以乙腈－0.1%磷酸溶液 (40∶60，每100 mL含十二烷基硫酸鈉0.1 g)的分離效果最好。在此色譜條件下，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和其他組分均能達(dá)到基線(xiàn)分離。

處方中菝葜和歐菝葜根藥材來(lái)源為同屬植物，均含有菝葜皂苷類(lèi)成分［4，15］，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)缺菝葜的空白制劑也可檢出薯蕷皂苷元，故暫把薯蕷皂苷元做為菝葜和歐菝葜根的鑒別，專(zhuān)屬性更強(qiáng)的鑒別方法有待于進(jìn)一步研究。

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