申玉超，于曉玲，張秀梅

遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121001

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎，嚴重危害人類健康。近年來內(nèi)皮損傷學說得到了多數(shù)學者支持，內(nèi)皮功能不全被認為是AS發(fā)生機制中的始動環(huán)節(jié)，因而對內(nèi)皮細胞損傷進行藥物干預治療，也成為心血管疾病領(lǐng)域研究的一個新的趨勢[1]。Lee等[2]激活內(nèi)皮細胞的Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)信號通路，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞功能紊亂，單核細胞對血管內(nèi)皮的黏附性增強，但內(nèi)皮細胞黏附分子表達并未增加，因此推斷Wnt/β-catenin信號通路可能與AS的發(fā)生機制有關(guān)[3-4]。本文通過研究阿托伐他汀對氯化鋰誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞Wnt信號通路相關(guān)因子Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達的影響，探討AS與Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系及阿托伐他汀抗AS的可能機制。

材料和方法

1 材料和試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購 自 ATCC公司；胎牛血清、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自?？寺∩镉邢薰?北京)；Licl購自北京協(xié)生生物科技有限公司；阿托伐他汀原粉購自輝瑞公司；兔抗人Wnt1抗體購自巴傲得生物科技有限公司；鼠抗人β-catenin抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人dvl1抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 實驗細胞與分組 HUVECs的培養(yǎng) 用含體積分數(shù)10%胎牛血清的1640細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，體積分數(shù)5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，1~2 d換液1次。以0.25%胰蛋白酶消化及傳代，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、選擇生長良好的4~6代的細胞用于實驗。細胞分為3組：1)空白對照組：細胞不加任何干預；2)Licl組：加入終濃度為20 mmol/L的Licl；3)阿托伐他汀組：加入終濃度為20 mmol/L的Licl+10 μmol/L的阿托伐他汀共同處理。各組經(jīng)卵育24 h后，收集細胞及培養(yǎng)的上清液，觀察不同組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白的表達及培養(yǎng)液中NO含量的變化。

3 HUVECs形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡觀察各組處理24h后HUVECs的形態(tài)學變化。

4 HUVECs的NO含量 用硝酸還原酶特異性將NO3-還原NO2-，通過顯色深淺測定其濃度高低。吸取各組中的細胞培養(yǎng)液，按南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行檢測。

5 免疫組織化學法檢測蛋白的表達 將第4代細胞接種在有蓋玻片(多聚賴氨酸處理好)的6孔板中進行細胞爬片。4 ℃10%甲醛固定30 min，30%H2O21份+純甲醇9份室溫浸泡15 min，封閉液37 ℃孵育30 min，加兔抗人Wnt1、鼠抗人β-catenin、兔抗人dvl-1抗體(1∶600)于4 ℃過夜;加二抗A液37 ℃卵育30 min，加二抗B液37 ℃孵育30 min，顯色、復染。以上每步之間用PBS沖洗3次，每次4 min；顯色、復染，脫水、封片。鏡下觀察蛋白表達。

6 Western blot法檢測蛋白表達 收集各組細胞，超聲裂解細胞，4 ℃ 1 000 g離心2 min，取上清液，用考馬斯亮藍法蛋白定量。取20 μl蛋白質(zhì)樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別滴加兔抗人Wnt1、鼠抗人β-catenin、兔抗人dvl-1(1∶400)抗體，4 ℃孵育過夜，相應堿性磷酸酶標記的二抗室溫孵育2 h，堿性磷酸酶法顯色。于掃描儀上成像，并用GENE GENIUS軟件對條帶進行灰度值半定量進行分析。以肌動蛋白(β-actin，分子量為43 kU)為內(nèi)參照，Wnt1(分子量為40 kU)、β-catenin(分子量為92 kU)及dvl-1(分子量為76 kU)與β-actin條帶灰度值的比值代表各蛋白表達的相對量。

7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料用-x±s表示，組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩差異采用SNK檢驗。P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 倒置顯微鏡觀察各組的形態(tài)學變化

圖2 免疫組化法檢測各組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達 A：Wnt1抗體； B：β-catenin抗體； C：dvl-1抗體

結(jié) 果

1 HUVECs形態(tài)學觀察 對照組細胞倒置顯微鏡下呈單層鋪路石狀鑲嵌排列，互不重疊，細胞邊界清晰，呈多角形；Licl組細胞收縮變圓，細胞間隙增寬，邊界不清，部分細胞脫落；阿托伐他汀組細胞間隙較Licl組窄，細胞形態(tài)趨于對照組。見圖1。

2 各組HUVECs的NO含量比較 與對照組比較，Licl組及阿托伐他汀組細胞培養(yǎng)的上清液中一氧化氮含量顯著減少(P＜0.01)；與Licl組比較，阿托伐他汀組細胞培養(yǎng)的上清液中一氧化氮含量顯著減少(P＜0.01)。見表1。

3 各組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達 利用免疫組化法檢測，對照組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白在細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色淡染顆粒；與對照組比較，Licl組細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量棕色顆粒聚集、濃染；阿托伐他汀組較對照組細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較多棕黃色顆粒，但較Licl組棕黃色顆粒明顯少。見圖2。利用Western blot法檢測，與對照組相比，Licl組和阿托伐他汀組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白定量明顯上升(P＜0.01)；與Licl組相比，阿托伐他汀組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白定量明顯降低(P＜0.01)。見表1、圖3。

表1 各組HUVECs的NO含量及Wnt1，β-catenin，dvl-1表達的比較, n=6)

表1 各組HUVECs的NO含量及Wnt1，β-catenin，dvl-1表達的比較, n=6)

aP＜0.01，與對照組相比較；bP＜0.01，與Licl組相比較

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圖3 Western blot法檢測各組HUVECs的Wnt1，β-catenin， dvl-1蛋白表達電泳圖

討 論

Wnt信號通路至少分為3個分支[5]：經(jīng)典Wnt信號 通路(Wnt/β-catenin信號通路)，Wnt/JNK信號通路，Wnt/Ca2+信號通路。通過上述途徑影響細胞的增殖，分化及凋亡。本研究主要探討Wnt/β-catenin信號通路，正常情況下此通路處于關(guān)閉狀態(tài)，當被激活時Wnt蛋白表達增多，與其受體卷曲蛋白(frizzled)結(jié)合，激活dvl-1，使糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)活性受抑制，胞內(nèi)β-catenin水平升高，入細胞核識別淋巴樣增強因子/白細胞增強因子(Tcf/Lef)[6-7]。β-catenin入細胞核形成Tcf-β-catenin復合物，它可與鈣黏蛋白啟動子區(qū)結(jié)合，從而下調(diào)鈣黏蛋白的表達[8]。鈣黏蛋白表達減少，使內(nèi)皮細胞間黏附功能下降，細胞間縫隙形成、通透性增加，從而導致炎癥細胞侵入血管內(nèi)皮下致AS形成。有報道證實了Wnt/β-catenin信號通路在內(nèi)皮細胞黏附連接重建中居于重要地位[9-10]。Lee等[2]激活內(nèi)皮細胞的Wnt/β-catenin信號通路，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞功能紊亂，單核細胞對血管內(nèi)皮的黏附性增強，但內(nèi)皮細胞黏附分子表達并未增加。綜上推斷Wnt/β-catenin信號通路激活與AS的形成有關(guān)。

阿托伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HUG-CoA)還原酶選擇性抑制劑，是廣為應用的他汀類藥物，其除有降脂作用外，還具有獨特的心血管疾病防治作用。Haidari等[11]發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀通過抑制血管內(nèi)皮細胞鈣黏蛋白酪氨酸磷酸化保護內(nèi)皮細胞間的黏附功能。

本研究通過Wnt信號通路激活劑Licl誘導HUVECs，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞分泌的NO明顯減少，同時Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達明顯升高，證明在這一過程Wnt/β-catenin信號通路激活。在Licl誘導HUVECs的同時加入阿托伐他汀，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞分泌的NO明顯增加，同時Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達明顯降低，證明在這一過程Wnt/β-catenin信號通路被抑制。本研究證實了Wnt/β-catenin信號通路激活可能與AS的形成有關(guān)，而阿托伐他汀抗AS可能與其抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

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